පීටර් සර්නෝ විසින් සංස්කරණය කරන ලදී, ස්ටැන්ෆර්ඩ් විශ්ව විද්‍යාලයේ වෛද්‍ය විද්‍යාලය, ස්ටැන්ෆර්ඩ් විශ්ව විද්‍යාලය, කැලිෆෝනියා, 2020 දෙසැම්බර් 25 දින අනුමත කරන ලදී (සමාලෝචනය කරන ලද්දේ 2020 ඔක්තෝබර් 25)
පිටපත් කිරීම සහ පරිණාමීය සංරක්ෂණය සඳහා අත්‍යවශ්‍ය වන කොරොන වයිරස්-පිටපත් කිරීමේ සංකීර්ණවල ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමේදී උප ඒකක අතර අන්තර්ක්‍රියා අපි වාර්තා කරමු.nsp12 හා සම්බන්ධ NiRAN වසම ට්‍රාන්ස් හි නියුක්ලියෝසයිඩ් මොනොපොස්පේට් (NMP) ට්‍රාන්ස්පේස් ක්‍රියාකාරකම් ඇති බවට අපි සාක්ෂි සැපයූ අතර එහි ඉලක්කය ලෙස nsp9 (RNA බන්ධන ප්‍රෝටීනයක්) හඳුනා ගත්තෙමු.NiRAN මගින් Mn2+ අයන සහ යාබද සංරක්ෂිත Asn අපද්‍රව්‍ය මත රඳා පවතින ප්‍රතික්‍රියාවකදී සංරක්ෂිත nsp9 ඇමයිනෝ ටර්මිනස් වෙත NMP කොටසෙහි සහසංයුජ ඇමිණීම උත්ප්‍රේරණය කරයි.NiRAN ක්‍රියාකාරකම් සහ nsp9 NMPylation කොරෝනා වයිරස් අනුකරණය සඳහා අත්‍යවශ්‍ය බව සොයා ගන්නා ලදී.RNA වෛරස් කාණ්ඩයක RNA සංස්ලේෂණය ආරම්භ කිරීම ක්‍රියාකාරීව සහ පරිණාමීයව අනුකූල වන බවට උපකල්පනයේ පෙර නිරීක්ෂණවලට මෙම කැදලි වෛරස් එන්සයිම සලකුණෙහි ක්රියාකාරිත්වය සම්බන්ධ කිරීමට දත්ත අපට ඉඩ සලසයි.
Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae සහ අනෙකුත් පවුල් 12) හි RNA මත යැපෙන RNA පොලිමරේස් (RdRps) NiRAN ලෙස හඳුන්වන බහුප්‍රෝටීන වලින් නිකුත් කරන ව්යුහාත්මක නොවන ප්රෝටීන් (nsp) හි ඇමයිනෝ-පර්යන්ත (N-පර්යන්ත) වසම සමඟ සම්බන්ධ වේ. 1ab වෛරස් ප්‍රධාන ප්‍රෝටීස් (Mpro) වලින් සමන්විත වේ.මීට පෙර, ධමනි වෛරසය NiRAN-RdRp nsp ගේම GMPylation/UMPylation ක්‍රියාකාරකම් වාර්තා කරන ලද අතර, නියුක්ලියෝසයිඩ් මොනොපොස්පේට් (NMP) (දැනට නොදන්නා) වෛරසය සහ/හෝ සෛල biopolymerization දේවල් වෙත මාරු කිරීම සඳහා සංක්‍රමණිකයක් ජනනය කිරීමට යෝජනා කරන ලදී.මෙහිදී, අපි පෙන්නුම් කරන්නේ කොරෝනා වයිරසය (Human Coronavirus [HCoV]-229E සහ Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) හි Mn2+ - යැපෙන NMPylation ක්‍රියාකාරකම් ඇති බවත්, එය Mpro-මැදිහත් වූ nsp9 සෑදීමෙන් පසුව nsp9 වෙතින් ව්‍යුත්පන්න වන බවත්ය. N-ටර්මිනල් ෆ්ලැන්කින්ග් nsps ප්‍රෝටියොලිතිකව මුදා හරිනු ලැබේ, පොස්පරමයිඩේට් nsp9 හි N-පර්යන්තයේ ප්‍රාථමික ඇමයින් (N3825) සමඟ බන්ධනය වේ.මෙම ප්‍රතික්‍රියාවේදී යූරිඩින් ට්‍රයිපොස්පේට් වඩාත් කැමති නියුක්ලියෝටයිඩ වේ, නමුත් ඇඩිනොසීන් ට්‍රයිපොස්පේට්, ගුවානොසීන් ට්‍රයිපොස්පේට් සහ සයිටිඩින් ට්‍රයිපොස්පේට් ද සුදුසු සම උපස්ථර වේ.ප්‍රතිසංයෝජක කොරෝනා වයිරස් nsp9 සහ nsp12 ප්රෝටීන සහ ජානමය වශයෙන් සකස් කරන ලද HCoV-229E විකෘති භාවිතා කරන විකෘති අධ්‍යයනයන් NiRAN-මැදිහත් වූ nsp9 NMPylation සහ සෛල සංස්කෘතිය තුළ වෛරස් ප්‍රතිවර්තනය සඳහා අවශ්ය අපද්‍රව්‍ය තීරණය කරන ලදී.දත්ත මගින් NiRAN සක්‍රීය අඩවි අපද්‍රව්‍ය පිළිබඳ පුරෝකථනය තහවුරු කරන ලද අතර nsp9 NMPylation සහ vitro හි වෛරස් ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමේදී nsp9 N3826 අවශේෂවල වැදගත් කාර්යභාරය තීරණය කරන ලදී.මෙම අපද්‍රව්‍යය සංරක්ෂිත N-පර්යන්ත NNE ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ අනුක්‍රමයේ කොටසක් වන අතර කොරෝනා වයිරස් පවුල තුළ nsp9 සහ එහි සමජාතීය වල එකම වෙනස් නොවන අවශේෂය බව ඔප්පු විය.මෙම අධ්‍යයනය අනෙකුත් කැදලි වෛරස් වල NMPylation ක්‍රියාකාරකම් පිළිබඳ ක්රියාකාරී අධ්‍යයනය සඳහා ශක්තිමත් පදනමක් සපයන අතර ප්‍රතිවෛරස් ඖෂධ සංවර්ධනය සඳහා හැකි ඉලක්ක යෝජනා කරයි.
Nidovirales ධනාත්මක ස්ට්රැන්ඩ් RNA වෛරසය විවිධ පෘෂ්ඨවංශීන් සහ අපෘෂ්ඨවංශීන් (1, 2) ආසාදනය කරයි.මෙම ඇණවුමට දැනට පවුල් 14 ක් (3) ඇතුළත් වන අතර, එයින් කොරෝනා වයිරස් පවුල පසුගිය වසර 20 තුළ පුළුල් ලෙස අධ්‍යයනය කර ඇත.එම අවස්ථාවේදී, සත්ව ධාරකයන්ගෙන් zoonotic කොරෝනා වයිරස් තුනක් මතු වූ අතර මිනිසුන් තුළ දරුණු ශ්වසන ආසාදන විශාල පරිමාණයෙන් පැතිර ගියේය.දරුණු උග්‍ර බෝවෙන රෝග නිසා ඇතිවන නොනවතින වසංගත ඇතුළුව.ශ්වසන සින්ඩ්‍රෝමය කොරෝනා වයිරස් 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviruses පොදු ප්‍රවේණික සංවිධානයක් බෙදා ගන්නා අතර, පටල-බැඳුණු ප්‍රතිනිර්මාණ-පරිවර්තන සංකීර්ණයේ (RTC) අනු ඒකකය 5-?²-පර්යන්ත තුනෙන් දෙකක සහ වෛරස් අංශුවේ ප්‍රධාන ව්යුහාත්මක අනු ඒකකයේ මෙන්ම සමහර උපාංගවලද කේතනය කර ඇත. .ප්රෝටීන්, ජෙනෝමයේ 3??² අග තුනෙන් කේතනය කර ඇත (1).ප්ලැනේරියන් වෛරස් පවුලක් (මොනොවිරිඩේ) (8) හැර, සියලුම කැදලි වෛරස් RTC උප ඒකක විශාල විවෘත කියවීම් රාමු (ORF) ORF1a සහ ORF1b දෙකකින් කේතනය කරයි, ඒවා ප්‍රවේණික RNA වලින් පරිවර්තනය වේ.ORF1a බහු ප්රෝටීන් (pp) 1a සංකේතනය කරයි, සහ ORF1a සහ ORF1b ඒකාබද්ධව pp1ab සංකේතනය කරයි.ORF1a මගින් කේතනය කරන ලද ප්‍රධාන ප්‍රෝටීස් (Mpro) හි සාමාන්‍ය සහභාගීත්වය ඇතිව, pp1a සහ pp1ab යන දෙකම ප්‍රෝටියොලිතිකව විවිධ ව්යුහාත්මක නොවන ප්රෝටීන (nsps) බවට සකසනු ලැබේ, එය 3CLpro ලෙසද හැඳින්වේ, මන්ද එයට picornavirus හි 3Cpro සමඟ සම විද්‍යාව ඇත. 9)මෙම nsps විශාල ගතික RTC එකකට එකලස් කර ඇති බව සැලකේ, ප්‍රවේණික RNA සංශ්ලේෂණය (ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම) සහ උප ප්‍රවේණික RNA කට්ටලයක් (පිටපත් කිරීම) උත්ප්රේරක කරයි, සහ ORF1b (10? ? ?12).
මූලික RTC හට RNA මත යැපෙන RNA පොලිමරේස් (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) සහ RNA සැකසුම් එන්සයිම කිහිපයක් ඇතුළත් වන අතර ඒවා ප්‍රධාන වශයෙන් ORF1b සහ කොරෝනා වයිරස් පවුල තුළ කේතනය කර ඇත. Arterioviridae පවුල තුළ nsp9-nsp12 (යොමු 10ââ 12 බලන්න).RdRp සහ HEL1 කුරුල්ලන්ගේ කූඩු වෛරසයේ සංරක්ෂිත වසම් දෙකක් (පහෙන් එකක්) නියෝජනය කරන අතර අනෙකුත් RNA වෛරස් අතර සමජාතීයතාවයක් ඇත.pp1a හි කාබොක්සි-පර්යන්ත (C-පර්යන්ත) ප්‍රදේශයෙන්, Mpro හි පහළ ප්‍රවාහයෙන් (පිළිවෙලින් කොරොන වයිරස් nsp5 සහ ධමනි වෛරස් nsp4) මුදා හරින ලද කුඩා nsps කිහිපයක් ඇතුළුව අනෙකුත් උප ඒකක මගින් මූලික අනුවර්තනයට සහාය වනු ඇතැයි විශ්වාස කෙරේ.ඔවුන්ට සීමිත පවුල්-විශේෂිත ආරක්ෂාවක් සහ විවිධ ක්‍රියාකාරකම් ඇත (යොමු 10ââ12 හි සමාලෝචනය කර ඇත).
සාපේක්ෂව මෑතදී, සියලුම කැදලි වෛරස් වල RdRp ට යාබද ඇමයිනෝ ටර්මිනස් (N-terminus) හි අද්විතීය අනුක්‍රමික මෝස්තර ලක්ෂණ සහිත වසමක් හමු වූ නමුත් වෙනත් RNA වෛරස් නොමැත (16).එහි පිහිටීම සහ නියුක්ලියෝටයිඩ මාරුකිරීමේ (නියුක්ලියෝසයිඩ් මොනොපොස්පේට් [NMP] මාරුකිරීමේ) ක්‍රියාකාරකම් මත පදනම්ව, මෙම වසම NiRAN (Nestvirus RdRp-ආශ්‍රිත නියුක්ලියෝටයිඩ හුවමාරුව) ලෙස නම් කර ඇත.NiRAN-RdRp ද්විත්ව වසම් සංයෝගය Coronaviridae පවුලේ nsp12 සහ Arterioviridae පවුලේ nsp9 සහ අනෙකුත් nestoviridae වලදී, NiRAN-RdRp වෛරස් පොලිප්‍රෝටීන වලින් ස්වාධීන nsp ලෙස මුදා හැරීමට අපේක්ෂා කෙරේ.කොරෝනා වයිරසයේ, NiRAN වසමෙහි ??1/450 අවශේෂ අඩංගු වන අතර සම්බන්ධක කලාපය හරහා C-terminal RdRp වසම වෙත සම්බන්ධ වේ (16.19).Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) හි ප්‍රතිසංයෝජක nsp9 මගින් Mn2+ අයන මත යැපෙන (ස්වයං) UMPylation සහ GMPylation ක්‍රියාකාරකම් පෙන්නුම් කරයි, එය nestovirus, AN, BN සහ CN හි සංරක්ෂිත අනුක්‍රමික පදනම් තුනක් මත රඳා පවතී.N යනු NiRAN සඳහා වන තැන) (16).මෙම මෝස්තරවල N-පර්යන්තය අඩු ගතානුගතික මෝස්තරයක් preAN වේ.මෙම අපද්‍රව්‍යවලින් සමහරක් දුරස්ථ ආශ්‍රිත ප්රෝටීන් කයිනේස් වලද සංරක්ෂණය කර ඇති අතර, ඒවා නියුක්ලියෝසයිඩ් ට්‍රයිපොස්පේට් (NTP) බන්ධන සහ උත්ප්රේරක ක්‍රියාකාරකම්වල (20, 21) සම්බන්ධ වී ඇති බව පෙන්වා දී ඇත.මෙම නිරීක්ෂණයට අනුකූලව, මෑතකදී ප්‍රකාශයට පත් කරන ලද SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 සුපිරි සංකීර්ණය සමඟ Pseudomonas syringae වෙතින් pseudokinase SelO හි ප්‍රධාන සක්‍රීය අඩවි අපද්‍රව්‍ය කිහිපයක් එකලස් කළ හැකිය.ඉලෙක්ට්‍රෝන ක්ෂුද්‍ර ව්‍යුහයේ අධිස්ථාපනය කරන ලද සංරක්ෂණය කරන ලද කොරෝනා වයිරස් NiRAN අවශේෂ.ප්රතිසංයෝජන ප්රෝටීන් (17).ලේඛනගත (ස්වයං) U/GMPylation NMP (දැනට නොදන්නා) උපස්ථරයට (16) මාරු කිරීම සඳහා සංක්‍රාන්ති තත්වයක් ඇති කරනු ඇතැයි අනුමාන කෙරේ, සහ NiRAN සහ ප්රෝටීන් kinase (17, 19) අතර ව්යුහාත්මක සමානතාවය ) කල්පිතය වන්නේ NiRAN අනෙකුත් ප්රෝටීන වෙනස් කරයි.
කැදලි වෛරස් සමඟ එහි අද්විතීය සහ අද්විතීය ක්‍රමානුකූල සම්බන්ධය සහ RdRp වෙතින් ජානමය වෙන්වීම ඇතුළු බොහෝ විශේෂාංග, NiRAN කැදැලි වෛරස් සඳහා සාධාරණ ප්‍රධාන නියාමන එන්සයිමයක් බවට පත් කරයි, එය ඔවුන්ගේ මතුවීම සහ අනන්‍යතාවයට ඉතා වැදගත් වේ.මින් පෙර, ජාන/උපජෙනොමික් පරිවර්තනය හෝ අනුකරණය/පිටපත් කිරීම නියාමනය කිරීම සඳහා NiRAN සම්බන්ධ විය හැකි කාර්යයන් තුනක් ලෙස හැඳින්විණි.එකල පවතින හිඟ සහ අසම්පූර්ණ දත්ත සලකා බැලීමේදී, එක් එක් කාර්යයට එහි වාසි සහ අවාසි ඇත (16).මෙම පර්යේෂණයේ දී, මෙම අභිරහස් ක්ෂේත්‍රය පිළිබඳ අවබෝධයක් ලබා ගැනීම සඳහා, මෙම වර්ග දෙක නියෝජනය කරන කොරොන වයිරස් වල ජෛව රසායනික හා ප්‍රතිලෝම ජාන අධ්‍යයනයන් ඒකාබද්ධ කිරීම සහ අපගේ සොයාගැනීම් කොරෝනා වයිරස් පවුලේ ස්වාභාවික විකෘතියේ පරිණාමීය පසුබිම තුළ තැබීම අපගේ අරමුණයි.RTC හි ස්වභාවික ඉලක්ක හඳුනාගැනීම හරහා NiRAN අවබෝධ කර ගැනීමේ ප්‍රධාන දියුණුව අපි වාර්තා කරන්නෙමු, එය (පවතින උපකල්පන තුන අතරින්) කැදැලි වෛරස් RNA සංශ්ලේෂණය ආරම්භ කිරීමේදී මෙම වසමේ භූමිකාවට දායක වේ.මෙම පර්යේෂණය වෛරස් ධාරක අතුරුමුහුණත මත NiRAN හි අනෙකුත් භූමිකාවන් සඳහා ද විවර කරයි.
corona virus nsp12-ආශ්‍රිත NiRAN වසමෙහි එන්සයිම ගුණ සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා, අපි C-terminus හි His6 ටැගය සමඟ E. coli හි මානව කොරොන වයිරස් 229E (HCoV-229E) nsp12 හි ප්‍රතිසංයෝජක ආකාරයක් නිෂ්පාදනය කළෙමු. ද්රව්ය සහ ක්‍රමවල විස්තර කර ඇති පරිදි [α32-P ] සහිත ප්රෝටීන් MnCl2 ඉදිරියේ NTP සමඟ එක්ව ඉන්කියුබේට් කරන්න.ප්රතික්රියා නිෂ්පාදනයේ විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ nsp12 (106 kDa) සමඟ සම-සංක්‍රමණය වන රේඩියෝ ලේබල් කළ ප්‍රෝටීනයක් පවතින බවයි, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ කොරොන වයිරස් nsp12 සහසංයුජ ප්රෝටීන්-NMP ඇඩෝන සෑදීම උත්ප්‍රේරණය කරන බවයි, මනාපයෙන් යූරිඩින් මොනොපොස්පේට් (UMP) (රූපය 1A) සහ බී).ප්‍රමාණාත්මක විශ්ලේෂණය පෙන්නුම් කළේ අනෙකුත් නියුක්ලියෝටයිඩ හා සසඳන විට UMP සංස්ථාපිතයේ සංඥා තීව්‍රතාවය 2 සිට 3 ගුණයකින් වැඩි වී ඇති බවයි (රූපය 1C).මෙම දත්ත කොරෝනා වයිරසයේ (16) NiRAN වසමේ පුරෝකථනය කරන ලද NMP මාරු කිරීමේ ක්‍රියාකාරකම් සමඟ අනුකූල වේ, නමුත් කොරෝනා වයිරසයේ සහ ධමනි වෛරසයේ NiRAN වසමේ නියුක්ලියෝටයිඩ මනාප වෙනස් බව පෙන්නුම් කරයි.
HCoV-229E nsp12 හි ස්වයං-NMPylation ක්‍රියාකාරකම්.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) නම් කරන ලද [α-32P] NTP සමඟ මිනිත්තු 30ක් සඳහා 6 mM MnCl2 ඉදිරියේ ඉන්කියුබේට් කරන ලදී (විස්තර සඳහා ද්රව්ය සහ ක්රම බලන්න).ප්රතික්රියා නිෂ්පාදන SDS-PAGE මගින් වෙන් කරන ලද අතර Coomassie දීප්තිමත් නිල් පැහැයෙන් වර්ණාලේප කර ඇත.(B) රේඩියෝ ලේබල් කරන ලද ප්‍රෝටීනය පොස්පරස් රූප මගින් දෘශ්‍යමාන වේ.nsp12-His6 සහ ප්රෝටීන් අණුක ස්කන්ධ සලකුණු (කිලෝඩෝල්ටන් වලින්) වල පිහිටීම A සහ B. (C) හි දැක්වෙන්නේ විකිරණශීලී සංඥාවේ (මධ්‍යන්‍ය ± SEM) තීව්‍රතාවය ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් තුනකින්.*P≤0.05.සංඥා ශක්තිය (ප්රතිශතය) UTP හා සම්බන්ධ වේ.
සෛල සංස්කෘතියේ (16) EAV සහ SARS-CoV අනුකරණය සඳහා NiRAN ආශ්‍රිත එන්සයිම ක්‍රියාකාරකම් අත්‍යවශ්‍ය බව පෙන්වා දී ඇතත්, නිශ්චිත NiRAN ශ්‍රිතය සහ විභව ඉලක්ක තවමත් නිර්ණය කර නොමැත.NiRAN සහ ප්රෝටීන් කයිනාස් වැනි නැමීම් සහිත ප්රෝටීන පවුලක් (17, 22) අතර මෑතදී වාර්තා වූ ව්යුහාත්මක සමානතාවය NiRAN අනෙකුත් ප්රෝටීන වල NMPylation උත්ප්‍රේරණය කරයි යන උපකල්පනය පරීක්ෂා කිරීමට අපව පොළඹවා ඇත.අපි HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) මගින් කේතනය කරන ලද ව්යුහාත්මක නොවන ප්රෝටීන ඇතුළු විභව සමජාතීය ඉලක්ක සමූහයක් ජනනය කළෙමු, ඒ සෑම එකක්ම C-terminal His6 ටැගය (SI උපග්රන්ථය, වගුව S1) අඩංගු වේ , සහ මෙම ප්රෝටීන [α32-P] යූරිඩින් ට්‍රයිපොස්පේට් ([α32-P]UTP) සමඟ nsp12 ඇති විට හෝ නොමැති විට පුරවන්න.E. coli හි නිපදවන Bovine serum albumin සහ MBP-LacZα විලයන ප්රෝටීන් පාලනයන් ලෙස ක්‍රියා කරයි (රූපය 2A, මංතීරු 1 සිට 7 දක්වා).විකිරණ ලේබල් කරන ලද ප්‍රෝටීනය සෝඩියම් ඩොඩෙසිල් සල්ෆේට්-පොලිඇක්‍රිලමයිඩ් ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රොෆොරේසිස් (SDS-PAGE) සහ ස්වයංක්‍රීය විකිරණ මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලද අතර, nsp12 සහ nsp9 අඩංගු ප්‍රතික්‍රියාවේ ප්‍රබල විකිරණශීලී සංඥාවක් ඇති බව සොයා ගන්නා ලදී.සංඥාවේ පිහිටීම nsp9 හි අණුක ස්කන්ධයට අනුරූප වේ, nsp9 හි nsp12-මැදිහත් වූ UMPylation පෙන්නුම් කරයි (රූපය 2B, ධාවන පථය 7).UMPylated වෙනත් කිසිදු පරීක්ෂණ ප්‍රෝටීනයක් සොයා නොගත් අතර, එය nsp9 යනු nsp12 හි නිශ්චිත උපස්ථරයක් බව නිගමනය කිරීමට අපට හේතු විය.රූප සටහන 1 හි පෙන්වා ඇති ස්වයං-NMPylation දත්ත වලට අනුකූලව, nsp12 ට NMPs හතරම nsp9 වෙත මාරු කිරීමට හැකි වේ, නමුත් කාර්යක්ෂමතාව වෙනස් වුවද, UMP> ඇඩිනොසීන් මොනොපොස්පේට් (AMP)> ගුවානොසීන් මොනොපොස්පේට් (GMP)> සයිටයිඩින් මොනොපොස්පේට් (CMP) ) ( පින්තූරය).3 A සහ B).මෙම විශ්ලේෂණයේ භාවිතා කර ඇති කොන්දේසි යටතේ (ප්රතික්රියාව සහ නිරාවරණ කාලය කෙටි කිරීම, nsp12 සාන්ද්‍රණය අඩු කිරීම; ද්රව්ය සහ ක්රම), nsp12 හි ස්වයං-NMPylation අනාවරණය කර ගත නොහැක (රූපය 2B, මංතීරුව 7, සහ රූපය 1B සසඳන්න), ඵලදායී (සහ බහු වට) UMP nsp12 සිට nsp9 දක්වා මාරු විය.UMP මාරුකිරීමේ ක්‍රියාකාරකම සඳහා රූප සටහන 3C හි පෙන්වා ඇති පරිදි Mn2+ අයන තිබීම අවශ්ය වන අතර, Mg2+ හමුවේ අවම UMP හුවමාරු ක්‍රියාකාරකම් පමණක් නිරීක්ෂණය වූ අතර අනෙකුත් ද්විසංයුජ කැටායන දෙක ඉදිරියේ ක්‍රියාකාරකමක් නොමැත.සයිටිඩින් ට්‍රයිපොස්පේට් (සීටීපී), ගුවානොසීන් ට්‍රයිපොස්පේට් (ජීටීපී) සහ ඇඩෙනොසීන් ට්‍රයිපොස්පේට් (ඒටීපී) අඩංගු එන්එම්පීලේෂන් විශ්ලේෂණයන්හි සමාන දත්ත ලබා ගන්නා ලදී (එස්අයි උපග්රන්ථය, රූප සටහන S1).
HCoV-229E nsp12-මැදිහත් nsp9 හි UMPylation.HCoV-229E nsp12-Homediated හි UMPylation ක්‍රියාකාරකම් ඇගයීම සඳහා ප්රෝටීන් උපස්ථර මාලාවක් (bovine serum albumin, MBP-lacZα, සහ ORF1a මගින් කේතනය කරන ලද C-terminal His6 සමඟ ලේබල් කරන ලද HCoV-229E nsps මාලාවක් ඇතුළුව) භාවිතා කරන ලදී. ප්රෝටීන්.ද්රව්ය සහ ක්‍රමවල විස්තර කර ඇති පරිදි nsp12 නොමැති (A) හෝ පැමිණීමේ (B) වලදී [α-32P] UTP සමඟ ප්රෝටීන් විනාඩි 10ක් පුර්ව ගන්වන්න.A සහ B හි මුදුනේ, Coomassie Brilliant Blue සමඟ වර්ණ ගැන්වූ SDS-polyacrylamide ජෙල් පෙන්වා ඇති අතර, A සහ B හි පහළින්, අනුරූප ස්වයංක්‍රීය රේඩියෝග්‍රෑම් පෙන්වනු ලැබේ.ප්රෝටීන් අණුක ස්කන්ධ සලකුණෙහි පිහිටීම (කිලෝඩෝල්ටන් වලින්) වම් පසින් දක්වා ඇත.nsp12-His6 (B, top) හි පිහිටීම සහ nsp9-His6 (B, පටුමග 7) සමඟ nsp12-His6 පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමේදී නිරීක්ෂණය කරන ලද විකිරණශීලී සංඥාව ද දක්වා ඇති අතර, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ [α-32P]UMP සිට nsp9-His6 දක්වා බවයි. (12.9 kDa), පරීක්ෂා කරන ලද අනෙකුත් ප්රෝටීන සඳහා නිරීක්ෂණය නොකළේය.
HCoV-229E NiRAN-මැදිහත් වූ ජෛව රසායනික සහ nsp9 NMPylation හි වෛරස් රෝග ලක්ෂණ.(A සහ B) ප්‍රතික්‍රියාවෙහි භාවිතා වන නියුක්ලියෝටයිඩ සම උපස්ථරයේ භූමිකාව.Nsp12-His6 සහ nsp9-His6 සම්මත NMPylation විශ්ලේෂණයේ විවිධ [α-32P] NTPs ඉදිරියේ මිශ්‍ර කර පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කර ඇත.(A, top) Coomassie-stained nsp9-His6 SDS-PAGE මගින් වෙන් කර ඇත.(A, පහළ) ජෙල් එකම ප්රදේශයේ Autoradiograph.(B) නම් කරන ලද නියුක්ලියෝටයිඩ කෝෆැක්ටරය හමුවේ සාපේක්ෂ ක්‍රියාකාරකම් (මධ්‍යන්‍ය ± SEM) ස්වාධීන පරීක්ෂණ තුනකින් තීරණය වේ.*P≤0.05.(C) ලෝහ අයන වල කාර්යභාරය.[α-32P] UTP සහ විවිධ ලෝහ අයනවල පවතින සම්මත NMPylation පරීක්ෂණය පෙන්වා ඇත, එක් එක් සාන්ද්‍රණය 1 mM වේ.C හි, ඉහළ, Coomassie stained nsp9-His6 පෙන්වනු ලබන අතර, C හි පහළ, අනුරූප ස්වයංක්‍රීය රේඩියෝ ග්‍රන්ථය පෙන්වයි.ලේබල් කරන ලද ප්‍රෝටීනයේ ප්‍රමාණය (කිලෝඩාල්ටන් වලින්) A සහ C වල වම් පසින් පෙන්වා ඇත. (D) HCoV-229E nsp12-His6 හි නිශ්චිත ඇමයිනෝ අම්ල ආදේශනය රැගෙන යන විකෘති ස්වරූපය [α-32P]UTP හි විස්තර කර ඇති පරිදි ඇත. ද්රව්ය සහ ක්රම වල.NMPylation ප්‍රතික්‍රියාවේදී නිපදවන විකිරණ ලේබල් කරන ලද nsp9-His6 ෆොස්ෆොරිලේෂන් රූප (D, top) මගින් අනාවරණය වේ.Wild-type (wt) ප්රෝටීන් හා සසඳන විට සාපේක්ෂ ක්‍රියාකාරකම් D හි පෙන්වා ඇති අතර, ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් තුනකින් පහළ සාමාන්‍යය (±SEM) ලෙස ගනු ලැබේ.තරු ලකුණු පෙන්නුම් කරන්නේ සංරක්ෂණය නොකළ අපද්‍රව්‍ය ආදේශ කිරීමයි.(E) ආසාදනය වී පැය 24 කට පසු ලබාගත් p1 සෛලවල සංස්කෘතික අධි ප්‍රවාහයේ වෛරස් ටයිටරය සමරු ඵලක විශ්ලේෂණය මගින් තීරණය කරන ලදී.ඉංජිනේරු HCoV-229E විකෘතියේ NiRAN වසමෙහි කෝඩෝන ආදේශන දක්වනු ලැබේ (අවශේෂ අංකනය pp1ab හි පිහිටීම මත පදනම් වේ).අනුකරණය-අඩුපාඩු RdRp ක්රියාකාරී අඩවිය විකෘති nsp12_DD4823/4AA පාලනයක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී.
NiRAN හි ක්රියාකාරී වෙබ් අඩවිය පිළිබඳ ගැඹුරු අවබෝධයක් ලබා ගැනීම සඳහා සහ nsp9-විශේෂිත NMP මාරුකිරීමේ ක්‍රියාකාරිත්වයට අදාළ අපද්‍රව්‍ය තීරණය කිරීම සඳහා, අපි NiRAN AN, BN සහ CN මෝස්තරවල ගතානුගතික අපද්‍රව්‍ය ප්‍රතිස්ථාපනය කරන ලද විකෘති විශ්ලේෂණය සිදු කළෙමු ( 16) එය ඇල (SI උපග්රන්ථය, රූපය S2).මීට අමතරව, කොන්සර්වේටිව් Arg-to-Lys හෝ Lys-to-Arg ආදේශනවල බලපෑම අවස්ථා දෙකකදී ඇගයීමට ලක් කරන ලදී.(සෘණ) පාලනයක් ලෙස, කොරොන වයිරස් සහ අනෙකුත් කැදලි වෛරස් වල NiRAN වසම තුළ සංරක්ෂණය නොකළ හෝ අඩු අවශේෂ, Ala සමඟ ප්‍රතිස්ථාපනය වේ. BN) සහ D4280A (CN) nsp12 හරහා nsp9 NMPylation සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කරයි හෝ ඉවත් කරයි, නමුත් ගතානුගතික ආදේශක (R4178K), K4116R) සහිත ප්රෝටීන ඒවායේ ක්‍රියාකාරිත්වයෙන් 60% සහ 80% රඳවා තබා ගනී, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ අදාළ පැත්තේ සීමාවන් ලිහිල් කරන බවයි. දාම භෞතික රසායනිකව සංවේදී වේ (රූපය 3D).වෙනත් සංරක්ෂිත අපද්‍රව්‍ය කිහිපයක් ප්‍රතිස්ථාපනය කිරීම E4145A, D4273A, F4281A සහ D4283A ඉතා අඩු හානිකර වන අතර nsp9 UMPylation මධ්‍යස්ථව පමණක් අඩු වේ.වෙනත් NTPs (Figure 3D සහ SI උපග්රන්ථය, Figure S3) සම්බන්ධ nsp9 NMPylation ප්රතික්රියා වලදී සමාන ප්රතිඵල ලබා ගන්නා ලදී, විශේෂිත ඇමයිනෝ අම්ල ආදේශන මත නිරීක්ෂණය කරන ලද බලපෑම් භාවිතා කරන නියුක්ලියෝටයිඩ සම-උපස්ථර වර්ගයෙන් ස්වායත්ත බව තහවුරු කරයි.මීළඟට, සෛල සංස්කෘතිය තුළ කොරෝනා වයිරස්වල ප්‍රතිවර්තනය කෙරෙහි මෙම nsp12 ආදේශකවල ඇති විය හැකි බලපෑම අපි පරීක්ෂා කළෙමු.මේ සඳහා, අපි සෛල 5 -7 පිටපත් කිරීම සඳහා ප්‍රතිසංයෝජක එන්නත් වයිරසයේ (23, 24) ක්ලෝන කරන ලද සුදුසු ජානමය ඉංජිනේරුමය අනුපූරක DNA (cDNA) සැකිලි භාවිතා කළෙමු.මෙම සෛල තුළ නිපදවන බෝවන වෛරස් පරම්පරාවේ අනුපිළිවෙලින් පෙන්නුම් කළේ බොහෝ HCoV-229E NiRAN විකෘති කළ නොහැකි බවයි (රූපය 3E).ශක්‍ය නොවන වෛරස් විකෘති සමූහයකට vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) NMP ස්ථාන මාරු ක්‍රියාකාරකම් ඉවත් කිරීමට හෝ සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කිරීමට පෙන්වා ඇති විකල්ප ඇතුළත් වේ, නමුත් වෙනත් විකල්ප දෙකක් ඇත (K4116R, E41045A) % වෙන්කර තිබේද?ඔවුන්ගේ in vitro NMPylation ක්‍රියාකාරකම් මඟින් අමතර සීමා කිරීම් සම්බන්ධ බව යෝජනා කරයි.ඒ හා සමානව, NiRAN හි in vitro NMPylation ක්‍රියාකාරකම්වල මධ්‍යස්ථ අඩුවීමක් ඇති කළ තවත් විකෘති දෙකක් (R4178K, F4281A) සජීවී වෛරස් නිපදවන නමුත්, මෙම වෛරස් ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම හරහා ටයිටර සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කළේය.රූප සටහන 3D හි පෙන්වා ඇති in vitro ක්‍රියාකාරකම් දත්ත වලට අනුකූලව, කොරෝනා වයිරස් සහ/හෝ වෙනත් කැදලි වෛරස් (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) තුළ සංරක්ෂණය කර නොමැති අනෙකුත් අපද්‍රව්‍ය හතරක් ප්‍රතිස්ථාපනය කරමින් (8, 16) පැවතුනද ශක්‍ය වෛරස් නිපදවන ලදී. වල් වර්ගයේ වෛරසයට සාපේක්ෂව මධ්‍යස්ථව අඩු කරන ලද ටයිටරයක් (රූපය 3E).
NiRAN-මැදිහත් වූ NMP හුවමාරු ක්‍රියාකාරකම් සක්‍රීය RdRp වසම මත රඳා පවතීද යන්න අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා, RdRp motif C හි ද්විසංයුජ ලෝහ අයන (11) සම්බන්ධීකරණයට සම්බන්ධ වන සංරක්ෂණ Asp අපද්‍රව්‍ය දෙක Ala මගින් ප්‍රතිස්ථාපනය කරන ලදී. එහි nsp9 NMPylation ක්‍රියාකාරකම්, nsp12-මධ්‍යගත in vitro nsp9 NMPylation ක්‍රියාකාරකම් සඳහා පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරකම් අවශ්ය නොවන බව පෙන්නුම් කරයි (SI උපග්රන්ථය, රූපය S4).
nsp12 සඳහා nsp9-විශේෂිත NMP මාරු කිරීමේ ක්‍රියාකාරකම් ස්ථාපිත කිරීමෙන් පසුව, අපි NMP-nsp9 එකතු කිරීම ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතිය (MS) මගින් සංලක්ෂිත කිරීමට උත්සාහ කළෙමු.ප්‍රතිසංයෝජක HCoV-229E nsp9 හි සම්පූර්ණ ප්රෝටීන් ස්කන්ධ වර්ණාවලිය 12,045 Da හි උපරිමයක් පෙන්නුම් කළේය (රූපය 4A).nsp12 එකතු කිරීම nsp9 හි ගුණාත්මක භාවය වෙනස් නොකළ අතර, nsp12 සහ nsp9 භාවිතා කරන ලද කොන්දේසි යටතේ (denaturation) ස්ථාවර සංකීර්ණයක් සාදනු නොලැබේ (Figure 4A).UTP සහ GTP හමුවේ, පිළිවෙලින් nsp9 සහ nsp12 අඩංගු ප්‍රතික්‍රියාවේ ස්කන්ධ මැනීමෙන් පෙන්නුම් කළේ UTP හි ප්රෝටීන් ස්කන්ධය 306 Da චලනය වන බවත්, GTP හි ප්රෝටීන් ස්කන්ධය 345 Da චලනය වන බවත්, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ සෑම nsp9 අණුවක්ම UMP හෝ GMP බන්ධනය කරන බවයි. (පින්තූර 4) C සහ D).NiRAN-මැදිහත් nsp9 NMPylation සඳහා අවශ්ය ශක්තිය NTP ජල විච්ඡේදනය සහ පයිරොපොස්පේට් මුදා හැරීමෙන් ලැබෙන බව අනුමාන කෙරේ.මෙම ප්‍රතික්‍රියාවේදී nsp12 (එන්සයිම) ට වඩා 10-ගුණයක molar අතිරික්තයක් භාවිතා කළද, nsp9 හි සම්පූර්ණ NMPylation නිරීක්ෂණය කරන ලදී, nsp12 සහ nsp9 අතර අන්තර්ක්‍රියා කෙටිකාලීන බව පෙන්නුම් කරන අතර nsp12 හට NMP9 වැඩි NMPylate කළ හැක. in vitro අණුව.
nsp12 සහ UTP හෝ GTP ඉදිරියේ nsp9 හි තනි NMPylation.HCoV-229E nsp9 (SI උපග්රන්ථය, වගුව S1) (AD) හි විසංයෝජනය වූ සම්පූර්ණ ප්රෝටීන ස්කන්ධ වර්ණාවලිය පෙන්වා ඇත.(A) nsp9 පමණක්, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP ඉදිරියේ, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP ඉදිරියේ.
Nsp12 මගින් UMPylated කරන ලද nsp9 අවශේෂ තීරණය කිරීම සඳහා, nsp9-UMP ට්‍රිප්සින් සමඟ වෙන් කරන ලදී.එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස පෙප්ටයිඩ නැනෝ-ඉහළ ක්රියාකාරී ද්‍රව වර්ණදේහ (HPLC) මගින් වෙන් කරන ලද අතර අන්තර්ජාලය හරහා ටැන්ඩම් ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (MS/MS) මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.Bionic මෘදුකාංග පැකේජය (Protein Metrics) භාවිතයෙන් දත්ත විශ්ලේෂණය N-පර්යන්ත ඇමයිනෝ අම්ලයේ UMPylation පෙන්නුම් කළේය.මෙය අතින් තහවුරු වේ.පූර්වගාමී පෙප්ටයිඩයේ ටැන්ඩම් ස්කන්ධ වර්ණාවලිය [UMP]NNEIMPGK (SI උපග්රන්ථය, Figure S5A) 421 m/z දී ඛණ්ඩයක් හෙළිදරව් කරන ලද අතර, UMP nsp9 හි අවශේෂ 1 ට බන්ධනය වන බව පෙන්නුම් කරයි.
Nsp9 හි N-පර්යන්තයේදී, Asn Orthocoronavirinae හි සාමාජිකයින් අතර සංරක්ෂණය කර ඇත (SI උපග්රන්ථය, රූපය S6).N-පර්යන්ත ප්‍රාථමික ඇමයින් නයිට්‍රජන් UMP සඳහා බොහෝ දුරට ඉඩ ඇති බව අපි විශ්වාස කළත්, N-පර්යන්තයේ NMP බන්ධනය පිළිබඳ අමතර සාක්ෂි ලබා ගැනීමට අපි තීරණය කළෙමු.මෙම හේතුව නිසා, HPLC මගින් පිරිසිදු කරන ලද NMPylated නොවන සහ NMPylated N-terminal peptide nsp9 ඇසිටෝන් සහ සෝඩියම් සයනොබොරෝහයිඩ්‍රයිඩ් හමුවේ ව්‍යුත්පන්න විය.මෙම තත්වයන් යටතේ, ප්‍රොපයිල් (25) සමඟ වෙනස් කළ හැක්කේ නිදහස් ප්‍රාථමික ඇමයින් පමණි.NNEIMPGK අනුක්‍රමය සහිත N-පර්යන්ත nsp9-ව්‍යුත්පන්න පෙප්ටයිඩයේ ප්‍රාථමික ඇමයින් දෙකක් අඩංගු වේ, එකක් Asn හි N-පර්යන්තයේ සහ අනෙක C-terminus හි Lys හි පැති දාමයේ.එබැවින්, ප්‍රොපයිල් කණ්ඩායම් දෙකෙහිම හඳුන්වා දිය හැකිය.NMPylated නොවන පෙප්ටයිඩ වල නිස්සාරණය කරන ලද අයන වර්ණදේහ SI උපග්‍රන්ථයේ, Figure S5B හි පෙන්වා ඇත.අපේක්ෂා කළ පරිදි, N-පර්යන්ත සහ C-පර්යන්ත (මොනෝ) ප්‍රොපිලේටඩ් (SI උපග්රන්ථය, රූපය S5B, ඉහළ මංතීරුව) සහ ඩිප්‍රොපිලේටඩ් පෙප්ටයිඩ (SI උපග්රන්ථය, රූපය S5B, පහළ මංතීරුව) හඳුනාගත හැකිය.nsp9 හි NMPylated N-terminal peptide භාවිතයත් සමඟ මෙම රටාව වෙනස් වේ.මෙම අවස්ථාවෙහිදී, C-පර්යන්ත ප්‍රොපිලේටඩ් පෙප්ටයිඩ පමණක් හඳුනාගත හැකි නමුත් N-පර්යන්ත ප්‍රොපිලේටඩ් පෙප්ටයිඩ සහ ඩිප්‍රොපිලේටඩ් පෙප්ටයිඩ හඳුනා නොගනී (SI උපග්රන්ථය, රූපය S5C), මෙය වළක්වා ගැනීම සඳහා UMP N-terminal ප්‍රාථමික ඇමයින් වෙත මාරු කර ඇති බව පෙන්නුම් කරයි. වෙනස්කම් සිදු කිරීමෙන් කණ්ඩායම.
මීලඟට, ඉලක්ක-විශේෂිත බාධාවන් නිර්වචනය කිරීම සඳහා අපි (Ala හෝ Ser සමඟ) ප්‍රතිස්ථාපනය කරන්නෙමු හෝ nsp9 හි N-පර්යන්තයේ සංරක්ෂිත අපද්‍රව්‍ය මකා දමන්නෙමු.nsp9 හි N-පර්යන්ත අපද්‍රව්‍යයේ ප්‍රාථමික ඇමයින් සමඟ NiRAN nsp9-NMP ඇඩක්ට් එකක් සාදන බව පෙන්වන අපගේ MS දත්ත මත පදනම්ව, nsp9 NMPylation හට nsp9 N-පර්යන්තය මුදා හැරීමට වෛරස් ප්‍රෝටීස් (Mpro, nsp5) අවශ්ය බව අපි උපකල්පනය කළෙමු. එහි බහු ප්රෝටීන් පූර්වගාමියා.මෙම උපකල්පනය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි E. coli හි nsp9 අඩංගු පූර්වගාමී ප්‍රෝටීනයක් nsp7-11 නිෂ්පාදනය කළ අතර [α-32P] UTP (ද්රව්ය සහ ක්රම) ඉදිරියේ සම්මත NMPylation පරීක්ෂණයක් සිදු කළෙමු.රූප සටහන 5A (Lane 3) හි පෙන්වා ඇති පරිදි, නොකැපූ nsp7-11 පූර්වගාමියා nsp12 සමඟ රේඩියෝ ලේබල් කර නොමැත.ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, පූර්වගාමියා වෙතින් nsp9 (සහ අනෙකුත් nsps) මුදා හැරීමට nsp7-11 ප්‍රතිසංයෝජක nsp5 මගින් වෙන් කරනු ලැබුවහොත්, nsp9 සමඟ සංක්‍රමණය වන රේඩියෝ ලේබල් කළ ප්‍රෝටීනයක් අනාවරණය කර ගන්නා අතර, NiRAN සහ N- වරණීය සහසංයුජ nsp9-NMP ආකලන බවට අපගේ නිගමනය තහවුරු කරයි. .N-පර්යන්ත Asn හි පර්යන්ත ප්‍රාථමික ඇමයින් (pp1a/pp1ab හි පිහිටීම 3825).මෙම නිගමනයට N-terminus හි අමතර අපද්‍රව්‍ය එකක් හෝ දෙකක් අඩංගු nsp9 construct භාවිතා කරන අත්හදා බැලීම් මගින් ද සහාය වේ.අවස්ථා දෙකේදීම, Nsp9 හි NiRAN-මැදිහත් වූ UMPylation අහෝසි කරන ලදී (SI උපග්රන්ථය, රූපය S7).මීළඟට, අපි nsp9 හි N-පර්යන්තයේ 3825-NNEIMPK-3832 පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලින් මකා දැමූ Asn අවශේෂ එකක් හෝ දෙකක් සහිත ප්‍රෝටීනයක් නිෂ්පාදනය කළෙමු.අවස්ථා දෙකේදීම, nsp9 UMPylation සම්පූර්ණයෙන්ම අවහිර කරන ලදී (රූපය 5B), සැබෑ nsp9 N-terminus NMP ප්‍රතිග්‍රාහකයක් ලෙස ක්‍රියා කරන බවට අමතර සාක්ෂි සපයයි.
nsp9 හි ප්‍රෝටෝලිටික් සැකසුම් සහ nsp12-මැදිහත් වූ UMPylation හි N-පර්යන්ත අපද්‍රව්‍යවල භූමිකාව.(A) nsp9 UMPylation සඳහා නොමිලේ nsp9 N-පර්යන්තයක් අවශ්ය වේ.Nsp7-11-His6 ප්‍රතිසංයෝජක Mpro (nsp5-His6) තිබීම හෝ නොපැවතීමේදී UTP අඩංගු NMPylation හඳුනාගැනීමේ බෆරයේ 30 °C දී පූර්ව-ඉන්කියුබේට් කර ඇත.පැය 3 කට පසු, ද්රව්ය සහ ක්‍රමවල විස්තර කර ඇති පරිදි nsp12-His6 එකතු කිරීමෙන් NMPylation විශ්ලේෂණය ආරම්භ කරන්න.nsp5-His6 (lane 1) සහ nsp9-His6 (lane 2) අඩංගු ප්රතික්රියාව පාලනයක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී.මිනිත්තු 10 කට පසු, ප්රතික්රියාව අවසන් වූ අතර ප්රතික්රියා මිශ්රණය SDS-PAGE මගින් වෙන් කරනු ලැබේ.ප්‍රෝටීනය Coomassie Brilliant Blue (A, top) වලින් වර්ණාලේප කර ඇත.Nsp7-11-His6 පූර්වගාමියා සහ nsp5-His6 මධ්‍යස්ථ ඛණ්ඩනයේ ප්‍රතිඵලයක් ලෙස සැකසූ නිෂ්පාදනය දකුණු පසින් පෙන්වා ඇත.(ඒවායේ කුඩා ප්‍රමාණය හේතුවෙන්) මෙම ජෙල් තුළ nsp7 සහ nsp11-His6 හඳුනාගත නොහැකි බව කරුණාවෙන් සලකන්න, සහ ප්රතික්රියාව nsp5-His6 සමඟ අතිරේක වේ (මංතීරු 1 සහ 4; nsp5-His6 පිහිටීම ඝන කවයකින් දැක්වේ) හෝ nsp9-His6 (Lane 2) හි MBP විලයන ප්රෝටීන (SI උපග්රන්ථය, වගුව S1) ලෙස ප්‍රකාශ වන බැවින් අවශේෂ අපද්‍රව්‍ය ලෙස කුඩා MBP (විවෘත කව මගින් දක්වනු ලැබේ) අඩංගු වේ.(B) Nsp9-His6 ප්‍රභේදයේ N-පර්යන්ත Asn අපද්‍රව්‍ය එකක් හෝ දෙකක් නොමැත (pp1a/pp1ab හි පිහිටුම අනුව අවශේෂ අංකනය) සහ nsp12-His6 සහ [α-32P] UTP සමඟ පිරිසිදු කර පුර්වීකරණය කර ඇත.B, Coomassie සමග වර්ණ ගැන්වූ SDS-PAGE ඉහළින් පෙන්වා ඇත, B, අනුරූප ස්වයංක්‍රීය රේඩියෝග්‍රැපය පහළින් දැක්වේ.අණුක බර සලකුණෙහි පිහිටීම (කිලෝඩෝල්ටන් වලින්) වම් පසින් දැක්වේ.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-පර්යන්ත සංරක්ෂිත අපද්‍රව්‍ය Ala හෝ Ser සමඟ ප්‍රතිස්ථාපනය කරන ලද අතර, nsp12-His6 මැදිහත් වූ UMPylation ප්‍රතික්‍රියාවේදී එම ප්රෝටීන් ප්‍රමාණයම භාවිතා කරන ලදී.ප්රතික්රියා නිෂ්පාදන SDS-PAGE මගින් වෙන් කර Coomassie Brilliant Blue (C, top) වලින් වර්ණාලේප කරන ලද අතර විකිරණ ලේබල් කරන ලද nsp9-His6 ෆොස්ෆොරෙසන්ස් රූප (C, මැද) මගින් අනාවරණය කර ගන්නා ලදී.Wild-type (wt) ප්‍රෝටීනය යොමුවක් ලෙස භාවිතා කරමින් (100% ලෙස සකසා ඇත), සාපේක්ෂ NMPylation ක්‍රියාකාරකම් (මධ්‍යන්‍ය ± SEM) ස්වාධීන පරීක්ෂණ තුනකින් ගණනය කරන ලදී.(D) HCoV-229E වල්-වර්ගයේ Huh-7 සෛල ආසාදනය වූ Huh-7 සෛලවල p1 සෛල සංස්කෘතියේ අධි ප්‍රවාහයේ වෛරස් ටයිටර සහ nsp9 හි නම් කරන ලද ඇමයිනෝ අම්ල ආදේශක රැගෙන යන විකෘති සමරු ඵලක විශ්ලේෂණය මගින් තීරණය කරන ලදී.අනුකරණ-අඩුපාඩු RdRp motif C ද්විත්ව විකෘති DD4823/4AA සෘණ පාලනයක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී.
nsp9 හි N-පර්යන්තය (විශේෂයෙන් ස්ථාන 1, 2, 3, සහ 6) Orthocoronavirinae උප පවුලේ සාමාජිකයන් අතර ඉතා සංරක්ෂණය කර ඇත (SI උපග්රන්ථය, රූපය S6).nsp12-මැදිහත් වූ nsp9 NMPylation හි මෙම අපද්‍රව්‍යවල විය හැකි කාර්යභාරය අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා, nsp9 හි N-පර්යන්තයේ අඛණ්ඩ Asn අවශේෂ දෙකක් Ala හෝ Ser (තනිව හෝ සංයෝජනයෙන්) ප්‍රතිස්ථාපනය කරන ලදී.Wild-type nsp9 හා සසඳන විට, N3825 වෙනුවට Ala හෝ Ser භාවිතා කිරීමෙන් nsp12-මැදිහත් වූ UMPylation දෙගුණයකටත් වඩා අඩු වීමක් සිදු විය (රූපය 5C).N-පර්යන්ත අපද්‍රව්‍යවල පැති දාමය වෙනුවට N-පර්යන්ත ප්‍රාථමික ඇමයින් හි NMPylation සිදු වන බවට අපගේ නිගමනයට අනුකූලව, N3825A සහ N3825S ප්‍රතිස්ථාපනය කිරීමත් සමඟ සැලකිය යුතු අවශේෂ NMPylation අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, දෙවන Asn Ala හෝ Ser මගින් ප්‍රතිස්ථාපනය කරන්නේ නම්, nsp9 UMPylation වඩා ප්‍රබල ලෙස අඩු වේ (10 වාරයකට වඩා වැඩි), නමුත් Ala 3, 4 සහ 6 ස්ථානවල ආදේශ කිරීම nsp9 UMPylation මත මධ්‍යස්ථ බලපෑමක් ඇති කරයි (රූපය 2 )5C).ATP, CTP හෝ GTP (SI උපග්රන්ථය, රූපය S8) භාවිතයෙන් සමාන ප්රතිඵල ලබා ගන්නා ලදී.සාමූහිකව, මෙම දත්ත nsp9 NMPylation හි N2826 (nsp9 හි 2 ස්ථානය) හි ප්‍රධාන භූමිකාව පෙන්නුම් කරයි.
nsp9 සහ NMPylation හි N-terminus අතර ක්රියාකාරී සහසම්බන්ධය පිළිබඳ අමතර සාක්ෂි ලබා ගැනීම සඳහා, අපි කොරෝනා වයිරස් පවුලේ nsp9 අනුපිළිවෙලෙහි බහු අනුක්‍රම පෙළගැස්මක් (MSA) සිදු කළෙමු (අපද්‍රව්‍ය 104 සහ 113 අතර වෙනස් වේ) (SI උපග්රන්ථය, රූපය S6).සමස්තයක් වශයෙන්, විවිධ ක්ෂීරපායින්, පක්ෂීන් සහ උරග ධාරකයන් ආසාදනය කරන Orthocoronavirinae උප කුලයේ 5 ගණයේ විශේෂ 47 (දන්නා සහ ප්‍රකාශිත) වලදී, වෙනස් නොවන බව සොයාගෙන ඇත්තේ 8 ක් පමණි.පෙර ව්යුහාත්මක අධ්‍යයනයන් (26 ??28) විසින් තීරණය කරන ලද පරිදි nsp9 හි ද්විතියික ව්‍යුහ මූලද්‍රව්‍ය අතර චක්‍ර තුළ මකාදැමීම් සහ ඇතුළත් කිරීම් ඇතුළුව වඩාත් පුළුල් වෙනස්කම් නිරීක්ෂණය විය.nsp9 හි C-පර්යන්ත කොටසෙහි β strand සහ α helix හි වෙනස් නොවන අපද්‍රව්‍ය පහක් හමු විය.වෙනස් නොවන අපද්‍රව්‍ය තුනක් nsp9 හි N පර්යන්තයේ NNE මෝස්තරය සාදයි.මෙම මෝස්තරයේ දෙවන Asn එකම වෙනස් නොවන අපද්‍රව්‍යය වන අතර එය දුරස්ථව සම්බන්ධ ගෙම්බා කොරෝනා වයිරසයේ උපකල්පිත nsp9 විසින් බෙදා ගන්නා අතර ඇල්ෆලෙටෝ වයිරස් හි ලෙටොවිරිනේ උප පවුලෙහි මයික්‍රොහයිලා ලෙටොවිරස් 1 විශේෂය නියෝජනය කරයි.nsp9 ද්විතියික ව්‍යුහ මූලද්‍රව්‍යවල අපද්‍රව්‍ය සංරක්ෂණය නැමීමේ හෝ දන්නා RNA බන්ධන ගුණාංග පවත්වා ගැනීම සඳහා ව්යුහාත්මක සලකා බැලීම් මගින් තාර්කික කළ හැක.කෙසේ වෙතත්, මෙම තර්කය NNE සංරක්ෂණයට අදාළ නොවන බව පෙනෙන්නට ඇති අතර, මෙම අධ්‍යයනයට පෙර, ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ අනුක්‍රමයේ විචලනය සීමා කරන සීමාවන්ගේ ස්වභාවය සම්පූර්ණයෙන්ම අඳුරු විය.
කොරොන වයිරස් ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමේදී nsp9-NMPylation සහ NNE සංරක්ෂණයේ වැදගත්කම තීරණය කිරීම සඳහා, අපි HCoV-229E විකෘති නිපදවන ලද අතර, ඒවා nsp9 N-පර්යන්ත අපද්‍රව්‍යවල තනි හෝ ද්විත්ව ආදේශන රැගෙන යන අතර, nsp9 NMPylation vitro හි හානිකර බව පෙන්නුම් කරයි.අප ආරම්භ කිරීමට පෙර, මෙම ආදේශන (nsp8|9 cleavage site අසල) C-terminal pp1a කලාපයේ ප්‍රෝටෝලිටික් සැකසීමට බලපාන්නේද යන ප්‍රශ්නයට පිළිතුරු දීමට අපි උත්සාහ කරමු.nsp9 හි N-පර්යන්තයේ අනුරූප ආදේශන අඩංගු nsp7-11 බහු ප්රෝටීන් නිර්මිත කට්ටලයක් E. coli හි නිෂ්පාදනය කර ප්‍රතිසංයෝජක Mpro සමඟ කපා ඇත.මෙම ප්රෝටීන වල ව්යුහාත්මක වෙනස්කම් හැර, Mpro-මැදිහත් වූ nsp8|9 cleavage (හෝ වෙනත්) වලට බාධා කරන මෙම ප්රෝටීන වල ව්යුහාත්මක වෙනස්කම් හැර, අඩවි හතරේ (nsp9 පැති සහිත අඩවිය ඇතුළුව) ප්‍රෝටියෝලයිටික් බෙදීම හඳුන්වා දී ඇති කිසිදු ආදේශකයකින් (SI උපග්රන්ථය, Figure S9) සැලකිය යුතු ලෙස බලපාන්නේ නැත. වෙබ් අඩවිය.
Huh-7 සෛල ප්‍රවේණි-දිග HCoV-229E RNA සමඟ සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද අතර, nsp9 N පර්යන්තයේදී සංරක්ෂණය කරන ලද NNE ට්‍රයිප්ටයිඩ (N3825, N3826, සහ E3827) තුළ Ala හෝ Ser ආදේශන කේතනය කරන ලද අතර, බොහෝ විකෘති මාරාන්තික බව පෙන්නුම් කරයි.N-terminal Asn (N2835A හෝ N2835S) හි Ser හෝ Ala ප්‍රතිස්ථාපනය කිරීමෙන් වෛරසය ගලවා ගැනීමට අපට හැකි විය, නමුත් NNE අනුපිළිවෙලෙහි (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, වෙනත් තනි සහ ද්විත්ව විකෘති සමඟ වෛරසය ප්‍රතිසාධනය කිරීමට අපොහොසත් විය. NN3825/6SS) , E3827A) (රූපය 5D).
මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කරන්නේ පටක සංස්කෘතිය තුළ කොරෝනා වයිරසවල ප්‍රතිවර්තනය සීමා කර ඇති බවයි (එකම හෝ සමාන), ශරීරයේ nsp9 NMPylation අඩවි වල ස්වාභාවික විකෘතිය සීමා කිරීම සහ කොරෝනා වයිරස් වල ජීවන චක්‍රයේ මෙම ප්‍රතිචාරයේ ප්‍රධාන භූමිකාවට සහාය වේ.
අවසාන අත්හදා බැලීම් මාලාවේදී, අපි SARS-CoV-2 nsp12 සහ nsp9 ලෙස ලේබල් කරන ලද C-terminal His6 සහ E. coli හි nsp12 හි විකෘති ආකාර දෙකක් නිෂ්පාදනය කළෙමු.NiRAN සහ RdRp වසම් වල සක්‍රිය අඩවි අවශේෂ පිළිවෙලින් Ala භාවිතා කරන්න (රූපය 6A සහ SI උපග්රන්ථය, වගුව S2).SARS-CoV-2 nsp12 හි K4465 HCoV-229E හි K4135 ට අනුරූප වේ (SI උපග්රන්ථය, රූපය S2), එය NiRAN ක්‍රියාකාරකම් සහ HCoV-229E අනුකරණය සඳහා අවශ්ය බව ඔප්පු විය (රූපය 3D සහ E).මෙම අවශේෂය NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16) සඳහා අවශ්ය බව කලින් පෙන්වා දුන් ධමනි වෛරස් EAV nsp9 K94 අවශේෂයට ද අනුරූප වේ.රූප සටහන 6B හි පෙන්වා ඇති පරිදි, SARS-CoV-2 nsp12 හි nsp9 උපස්ථරයක් ලෙස භාවිතා කරමින් UMP මාරු කිරීමේ ක්‍රියාකාරකම් ඇති අතර nsp12_K4465A සක්‍රීය අඩවි විකෘතිය අක්‍රිය වේ.RdRp motif C හි SDD ලාක්ෂණික අනුපිළිවෙලෙහි ද්විත්ව ආදේශනය UMP මාරු කිරීමේ ක්‍රියාකාරකම් වලට බලපාන්නේ නැත (රූපය 6B), RdRp ක්‍රියාකාරකම් nsp9 UMPylation හි සෘජු බලපෑමක් නොමැති බව පෙන්නුම් කරයි.CTP, GTP සහ ATP භාවිතයෙන් සමාන දත්ත ලබා ගන්නා ලදී (SI උපග්රන්ථය, රූපය S10).සාරාංශයක් ලෙස, මෙම දත්ත පෙන්නුම් කරන්නේ NiRAN-මැදිහත් වූ nsp9 NMPylation orthocoronavirus උප පවුලේ විවිධ ගණ නියෝජනය කරන කොරෝනා වයිරස් වල ගතානුගතික ක්‍රියාකාරකමක් ඇති බවයි.
SARS-CoV-2 nsp12-මැදිහත් NMP9 හි NMPylation.(A) Coomassie stained SDS-polyacrylamide gel NMPylation පරීක්ෂණයේදී භාවිතා කරන ප්රතිසංයෝජන ප්‍රෝටීනය පෙන්වයි.පාලනයක් ලෙස, SARS-CoV-2 nsp12 හි NiRAN වසම (K4465A) සහ RdRp වසම (DD5152/3AA) තුළ ක්රියාකාරී අඩවි ආදේශන සහිත විකෘති ප්‍රෝටීනයක් භාවිතා කරන ලදී.අවශේෂ අංකනය pp1ab හි පිහිටීම මත පදනම් වේ.(B) nsp9-His6 සහ [α-32P]UTP nsp12-His6 (වල් වර්ගය [wt] සහ විකෘති) උපස්ථරයක් ලෙස භාවිතා කරමින් UMPylation හඳුනාගැනීමේ ස්වයංක්‍රීය රේඩියෝග්‍රැෆ්.ලේබල් කරන ලද ප්‍රෝටීනයේ අණුක ස්කන්ධය (කිලෝඩෝල්ටන් වලින්) වම් පසින් දැක්වේ.
NiRAN වසම් සාමාන්‍යයෙන් Nidovirales (16) හි සංරක්ෂණය කර ඇත, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ ඒවා Nidovirus ප්‍රතිනිර්මාණය සඳහා අත්‍යවශ්‍ය එන්සයිම ප්රතික්රියා උත්ප්රේරක කරන බවයි.මෙම අධ්‍යයනයේදී, කොරොන වයිරසයේ NiRAN වසම NMP (NTP වලින් ජනනය කරන ලද) nsp9 වෙත මාරු කරන බව ඔප්පු කිරීමට අපට හැකි විය, එය වයිරස් ප්‍රතිනිර්මාණයට සම්බන්ධ අද්භූත RNA බන්ධන ප්‍රෝටීනයක් (26 ?? 29 ), එය ස්වභාවික ඉලක්කයක් ලෙස තීරණය කිරීමට සහ කොරෝනා වයිරස් RTC හි හවුල්කරු.
NiRAN වසම අනුක්‍රමික ආකෘතීන් තුනක් (AN, BN, සහ CN) බෙදා ගනී, ඒවායේ මොනොෆයිලටික් නමුත් බෙහෙවින් වෙනස් වූ Nidovirales අනුපිළිවෙලෙහි (8, 16) සියලුම පවුල්වල සංරක්ෂණය කර ඇති අපද්‍රව්‍ය ඉතා කුඩා සංඛ්‍යාවක් අඩංගු වේ.මෑත අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ ඒවා ව්‍යුහාත්මකව බොහෝ දුරට සංලක්ෂිත නොවන ප්රෝටීන් කයිනේස් වැනි ප්රෝටීන සහිත පවුලකට සම්බන්ධ වන අතර ඒවා මුලින් හැඳින්වූයේ SelO පවුල (17, 19, 22, 30, 31) ලෙසිනි.SelO ආශ්‍රිත ප්රෝටීන වල kinase folds ඇත, නමුත් සම්භාව්‍ය kinases (22, 32) තුළ සංරක්ෂිත ක්රියාකාරී අඩවි අපද්‍රව්‍ය කිහිපයක් නොමැත.ATP අණු වල ප්‍රතිලෝම දිශානතිය සක්‍රීය ස්ථානයට බැඳී නිශ්චිත අන්තර්ක්‍රියා මගින් ස්ථායී වීම මත පදනම්ව, SelO උපකල්පනය කරන ලද අතර පසුව AMP (පොස්පේට් වෙනුවට) ප්රෝටීන් උපස්ථරයට (22) මාරු කරන බව තහවුරු කරන ලද අතර තවත් බැක්ටීරියා SelO වැනි ප්‍රෝටීනයක් YdiU සතුව ඇත. ටයර් වෙත UMP හි සහසංයුජ ඇමිණීම සහ විවිධ ප්රෝටීන් උපස්ථරවල ඔහුගේ අපද්‍රව්‍ය උත්ප්රේරක කිරීමට මෑතකදී පෙන්වා දී ඇත (33).
කොරෝනා වයිරස් NiRAN වසමෙහි සක්‍රීය සක්‍රීය අඩවි අවශේෂ පිළිබඳ පුරෝකථනය තහවුරු කිරීම සහ පුළුල් කිරීම සඳහා, අපි කොරෝනා වයිරස් nsp12 මත විකෘති විශ්ලේෂණය සිදු කිරීමට ජෛව රසායනික සහ ප්‍රතිලෝම ජාන ක්රම භාවිතා කළෙමු (රූපය 3D සහ E සහ SI උපග්රන්ථය, රූපය S3 සහ වගුව) S1â S4).දත්ත පෙන්නුම් කරන්නේ HCoV-229E K4135, R4178 සහ D4280 Ala සමඟ ප්‍රතිස්ථාපනය කිරීමෙන් සෛල සංස්කෘතිය තුළ vitro NMP මාරු කිරීමේ ක්‍රියාකාරකම් සහ වෛරස් අනුවර්තනය ඉවත් කරන බවයි (රූපය 3D සහ E සහ SI උපග්‍රන්ථ, Figure S3), NTP γ-පොස්පේට් වල ඒවායේ පැවැත්මට සහාය වේ. (K4135, R4178) සහ ක්රියාකාරී අඩවියේ ලෝහ අයන සම්බන්ධීකරණය (D4280).K4135 (17) ස්ථානය ස්ථායී කිරීමට පුරෝකථනය කරන ලද කුරුළු කූඩුවේ පරාසයේ සංරක්ෂිත Glu හි E4145A ආදේශ කිරීම වෛරස් ප්‍රතිනිර්මාණය තුරන් කරන බව පෙන්නුම් කළ නමුත් පුදුමයට කරුණක් නම්, ක්‍රියාකාරකම් in vitro NMPylation විශ්ලේෂණය තුළ රඳවා තබා ගැනීමයි (රූපය 3D සහ E සහ SI උපග්රන්ථය, රූපය S3 සහ වගු S1-S4).සැල්මොනෙල්ලා ටයිෆිමුරියම් (E130A) (33) හි YdiU homolog හි අනුරූප ආදේශනය හඳුන්වා දුන් විට සමාන නිරීක්ෂණයක් සිදු කරන ලදී.එකට ගත් විට, මෙම දත්ත උත්ප්රේරක ශ්‍රිතයට වඩා මෙම සංරක්ෂිත අවශේෂයේ නියාමන කාර්යයට සහාය වේ.
HCoV-229E NiRAN වසම (8) තුළ nestovirus පරාසය තුළ සංරක්ෂණය කරන ලද Phe අපද්‍රව්‍ය (F4281A) ප්‍රතිස්ථාපනය කිරීමෙන් vitro හි NMPylation ක්‍රියාකාරකම්වල අඩුවීමක් සහ සෛල සංස්කෘතියේ වෛරස් ප්‍රතිවර්තනයේ සැලකිය යුතු අඩුවීමක් සිදු විය (Figure 3D, E සහ SI) උපග්රන්ථය, රූපය S3).දත්ත කලින් පෙන්වා ඇති සමජාතීය DFG මෝටිෆ් Phe අවශේෂය වැනි මෙම අවශේෂයේ වැදගත් නියාමන කාර්යයට අනුකූල වේ.සම්භාව්‍ය ප්රෝටීන් කයිනේස් වලදී, එය Mg2+ බන්ධන ලූපයේ කොටසක් වන අතර කොඳු ඇට පෙළ එකලස් කිරීමට සහ නියාමනය කිරීමට උපකාරී වේ???ඵලදායී උත්ප්රේරක ක්රියාකාරිත්වය සඳහා අවශ්ය වේ (32, 34).පිළිවෙලින් K4116 අපද්‍රව්‍ය සඳහා Ala සහ Arg ආදේශ කිරීම (preAN motif හි), වෛරස් ප්‍රතිනිර්මාණය ඉවත් කරන ලද අතර, අපේක්ෂා කළ පරිදි, හඳුන්වා දුන් ඇමයිනෝ අම්ල පැති දාමය මත පදනම්ව, vitro හි NMP මාරු කිරීමේ ක්‍රියාකාරකම් කෙරෙහි විවිධ බලපෑම් ඇති කළේය (Figure 3D සහ E සහ SI උපග්‍රන්ථ. , රූපය S3).ක්රියාකාරී දත්ත ව්යුහාත්මක තොරතුරු සමග අනුකූල වේ, මෙම අවශේෂය ATP පොස්පේට් (17) සමඟ අන්තර්ක්රියාකාරිත්වයක් ස්ථාපිත කර ඇති බව පෙන්නුම් කරයි.අනෙකුත් කැදලි වෛරස් පවුල්වල NiRAN වසම තුළ, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 හි පිහිටීම Lys, Arg හෝ His (8) විසින් අත්පත් කරගෙන ඇති අතර, මෙම නිශ්චිත අපද්‍රව්‍යයේ ක්රියාකාරී සීමාව ලිහිල් කර ඇති බව පෙන්නුම් කරයි.D4188A සහ D4283A ආදේශ කිරීම එන්සයිම ක්රියාකාරිත්වය ඉවත් කිරීම හෝ දැඩි ලෙස අඩු කිරීම සහ වෛරස් ප්‍රතිවර්තනය ඉවත් කිරීම (රූපය 3).මෙම අපද්‍රව්‍ය දෙක බොහෝ (නමුත් සියල්ලම නොවේ) කැදැලි වෛරස් (8) තුළ සංරක්ෂණය කර ඇති අතර, එය වැදගත් පවුලට විශේෂිත වූ නමුත් සමහර විට උත්ප්රේරක නොවන කාර්යයක් පෙන්නුම් කරයි.Coronaviridae හෝ වෙනත් Nestioviridae පවුල්වල (8) සංරක්ෂණය කර නොමැති වෙනත් Lys සහ Asp අපද්‍රව්‍ය කිහිපයක (K4113A, D4180A, D4197A සහ D4273A) Ala ආදේශන පාලන ලෙස භාවිතා කරන ලදී.අපේක්ෂා කළ පරිදි, මෙම ආදේශන බොහෝ දුරට ඉවසාගත හැකි අතර, එන්සයිම ක්‍රියාකාරිත්වයේ සුළු අඩුවීමක් සහ සමහර අවස්ථාවල වෛරස් ප්‍රතිනිර්මාණයක් (Figure 3 සහ SI උපග්රන්ථය, Figure S3).සමස්තයක් වශයෙන්, කොරෝනා වයිරස් විකෘති දත්ත EAV NiRAN-RdRp (16) හි ස්වයං-GMP සහ ප්‍රතිලෝම ජාන දත්ත සමඟ ඉතා අනුකූල වේ, එහි EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) අවශේෂ K94 (HCoV- 229E K4135 ට අනුරූප වන) වැදගත් ක්‍රියාකාරකම් වේ. R124 (R4178 ට අනුරූප), D132 (D4188 ට අනුරූප), D165 (D4280 ට අනුරූප), F166 (F4281 ට අනුරූප).මීට අමතරව, HCoV-229E mutagenesis දත්ත කලින් වාර්තා කරන ලද SARS-CoV ප්‍රතිලෝම ජාන දත්ත (16) සමඟ අනුකූල වන අතර පුළුල් කර ඇත, එය අනුරූප CN motif Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 සඳහා නිරීක්ෂණය කරන ලද ඒවාට බෙහෙවින් සමාන ය. ෆීනෝටයිප් විස්තර කර ඇත -F219A සහ HCoV-229E_F4281A (රූපය 3 D සහ E සහ SI උපග්රන්ථය, රූපය S3 සහ වගුව S1-S4).
UTP සහ GTP සඳහා පැහැදිලි මනාපයක් ඇති EAV orthologs (16) සමඟ සසඳන විට (ස්වයං-NMPylation ප්‍රතික්‍රියාවේදී), අපගේ අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ කොරෝනා වයිරස් NiRAN වසම (HCoV-229E සහ SARS-CoV-2 මගින් නියෝජනය වන) ඵලදායී විය හැකි බවයි. UMP සඳහා සුළු මනාපයක් තිබුණද, NMP හතරම මාරු කර ඇත (රූපය 1 සහ 3).නිශ්චිත NTP සම-උපස්ථරයෙහි සාපේක්ෂ අඩු විශේෂත්වය මෑතකදී වාර්තා කරන ලද SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 සුපිරි සංයුක්ත ව්‍යුහයට අනුකූල වේ, එහි ADP-Mg2+ NiRAN හි ක්රියාකාරී අඩවියට බන්ධනය වන නමුත් ඇඩිනීන් කොටස සමඟ නොවේ. නිශ්චිත අන්තර්ක්‍රියා ගොඩනැගීම (17).අපගේ අධ්‍යයනයේ දී, NMPylation ප්‍රතික්‍රියාවෙහි භාවිතා වන නියුක්ලියෝටයිඩ වර්ගය විකෘති ප්රෝටීන් (SI උපග්රන්ථය, Figure S3) ක්‍රියාකාරීත්වයට අවකල්‍ය බලපෑමක් ඇති නොකරයි, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ මෙම අපද්‍රව්‍ය කිසිවක් නිශ්චිත නියුක්ලියෝබේස් බන්ධනයට සමීපව සම්බන්ධ නොවන බවයි.කොරොන වයිරස් සහ ධමනි වෛරස් වල NiRAN වසම්වල නිරීක්ෂණය කරන ලද විවිධ NTP සම-උපස්ථර මනාපවල ව්යුහාත්මක පදනම සහ විභව ජීව විද්‍යාත්මක වැදගත්කම අධ්‍යයනය කිරීමට ඉතිරිව පවතී;ඒවා සත්‍ය විය හැකිය හෝ ඔවුන්ගේ අදාළ අධ්‍යයනවල සීමාවන් නිසා විය හැකිය.වර්තමානයේදී, ධමනි වෛරස් NiRAN වසමේ විභව NMPylator ක්‍රියාකාරකම් (පෙර සංලක්ෂිත ස්වයං-NMPylation ක්‍රියාකාරකම් හා සසඳන විට) වෙනස් සම-උපස්ථර මනාපයක් ඇති බව බැහැර කළ නොහැක, ධමනි සහ කොරෝනා වයිරසය අතර ඇති සමානතාවය සැලකිල්ලට ගනිමින්. NiRAN වසම එහි සීමාවේ ඇත.අනුපිළිවෙල මත පදනම් වූ සංසන්දනය (16).Mg2+ සහකාරකයක් ලෙස භාවිතා කරන pseudokinase SelO සමඟ සසඳන විට, කොරෝනා වයිරස් සහ ධමනි වෛරස් NiRAN වල ක්රියාකාරිත්වය Mn2+ (16) මත රඳා පවතී (රූපය 3C සහ SI උපග්රන්ථය, රූපය S1).Mn2+ යැපීම සහ UTP සඳහා පැහැදිලි මනාපය ප්රෝටීන් NMPylators හි අසාමාන්‍ය ලක්‍ෂණයක් වන අතර එය මෑතකදී තහවුරු වී ඇත්තේ සැල්මොනෙල්ලා ටයිෆිමියුරියම් හි YdiU ප්‍රෝටීනය තුළ වන අතර එය ආතති ප්‍රේරණයෙන් සෛල ආරක්ෂා කිරීම සඳහා දැඩි Mn2+ මත යැපෙන ප්රෝටීන් chaperone UMPylation උත්ප්‍රේරණය කරයි (Cell ATP pool) 33)
කොරෝනා වයිරස් NiRAN වසම සහ සෙලියුලර් ප්රෝටීන් kinases (17, 19) අතර මෑතදී විස්තර කරන ලද ව්යුහාත්මක සමානතාවය, මෙම අධ්‍යයනයේදී අප විසින් වාර්තා කර ඇති අනෙකුත් ප්රෝටීන සමඟ NMP සහසංයුජව සම්බන්ධ කිරීමට NiRAN ට ඇති හැකියාව සඳහා අමතර සහායක් සපයයි.RTC හි ORF1b-කේතනය කළ අනුරුවට (12, 35) සෘජුව හෝ වක්‍රව සහාය වීමට දන්නා HCoV-229E ORF1a මගින් කේතනය කරන ලද ප්රෝටීන මත විය හැකි NiRAN ඉලක්ක සඳහා අපගේ සෙවුම අපි යොමු කළෙමු.අපගේ අත්හදා බැලීම් මගින් nsp9 හි ඵලදායී සහ නිශ්චිත NMPylation සඳහා තීරණාත්මක සාක්ෂි සපයයි (රූපය 2).ඉලක්ක ප්‍රෝටීනය එන්සයිමයේ (nsp12) ට වඩා 8 සිට 10 ගුණයකින් වැඩි මෝලර් අතිරික්තයක භාවිතා කරන්නේ නම්, එය nsp9 සම්පූර්ණයෙන්ම (mono)NMPized බව තහවුරු වේ (රූපය 4).අපි නිගමනය කළේ nsp12 සහ nsp9 අතර අන්තර්ක්‍රියා කෙටිකාලීන වන අතර එය nsp9 සමඟ ස්ථායී සංකීර්ණයක් ඇති නොකරනු ඇති බවයි (අනෙකුත් RTC උප ඒකක නොමැති විට).මෙම නිගමනයට SARS-CoV ප්‍රෝටියෝමයේ (35) ප්රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා අධ්‍යයනයන් මගින් සහය දක්වයි.MS විශ්ලේෂණය මගින් nsp9 හි N-පර්යන්ත අවශේෂයේ ප්‍රාථමික ඇමයින් NMPylation අඩවිය ලෙස හඳුනාගෙන ඇත (SI උපග්රන්ථය, රූපය S5).ෆොස්ෆොරමිඩේට් බන්ධනය සහ N-පර්යන්ත ඇමයිනෝ කාණ්ඩය සෑදීම NiRAN-මැදිහත් වූ NMPylation ක්‍රියාකාරකම් Pseudomonas syringae SelO-මැදිහත් AMPylation ප්‍රතික්‍රියාවෙන් වෙන්කර හඳුනා ගනී, එය Ser, Thr හෝ Tyr අපද්‍රව්‍යවල O-සම්බන්ධිත AMP සෑදීම උත්ප්‍රේරණය කරයි. 22), සහ S. typhimurium YdiU O-linked (Tyr සමඟ) සහ N-linked (ඔහු සමඟ) peptide-UMP adducts සාදයි.ප්රෝටීන වල SelO පවුල පිළිබඳ ඇති සීමිත තොරතුරු පෙන්නුම් කරන්නේ මෙම විශාල ප්රෝටීන් පවුලේ සාමාජිකයන් පෙප්ටයිඩ-එන්එම්පී ආකලන සෑදීමේදී බොහෝ සෙයින් වෙනස් වන බවයි.මෙය වැඩිදුර අධ්‍යයනය කළ යුතු රසවත් නිරීක්ෂණයකි.
මෙම අධ්‍යයනයෙන් ලබාගත් දත්ත nsp9 හි NMPylation සඳහා නොමිලේ N-terminus එකක් අවශ්ය බව උපකල්පනය කිරීමට අපව යොමු කළේය.වෛරස් ප්‍රතිනිර්මාණයේ සන්දර්භය තුළ, මෙය Mpro සහ pp1ab මගින් මැදිහත් වන පොලිප්‍රෝටීන් pp1a අනුරූ තුළ nsp8|nsp9 සැකසුම් අඩවියේ ප්‍රෝටෝලිටික් ක්ලේවේජ් මගින් සපයනු ඇත.බොහෝ කිරීටක වෛරස් වල, මෙම නිශ්චිත වෙබ් අඩවිය (HCoV-229E හි VKLQ|NNEI) සහ අනෙකුත් සියලුම කොරෝනා වයිරස් Mpro ක්ලීවේජ් අඩවි අතර වෙනස Asn (Ala, Ser හෝ Gly වැනි වෙනත් කුඩා අවශේෂයක් වෙනුවට) P1â ද???ස්ථානය (36).මුල් අධ්‍යයනයන්හි දී ලබාගත් පෙප්ටයිඩ බෙදීම් දත්ත පෙන්නුම් කළේ nsp8|nsp9 අඩවියේ ක්ලේවේජ් කාර්යක්ෂමතාව අනෙකුත් වෙබ් අඩවි වලට වඩා අඩු බවයි, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ 1) C-පර්යන්තයේ කාලෝචිත සම්බන්ධීකරණ සැකසීමේදී මෙම නිශ්චිත අඩවියට නියාමන භූමිකාවක් තිබිය හැකි බවයි. pp1a කලාපය, හෝ 2) a වෛරස් ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමේදී විශේෂ සංරක්ෂණය කරන ලද nsp9 N-terminus හි භූමිකාව (37).අපගේ දත්ත (රූපය 5A) පෙන්නුම් කළේ සැබෑ N-පර්යන්ත අනුක්‍රමය රැගෙන යන nsp9 හි ප්රතිසංයෝජන ආකාරය nsp12 මගින් ඵලදායී ලෙස NMPකරණය කර ඇති බවයි.N-පර්යන්ත පැති අනුපිළිවෙල Xa සාධකය (nsp9-His6; SI උපග්රන්ථය, වගුව S1) හෝ Mpro-මැදිහත් වූ බෙදීම (nsp7-11-His6; රූපය 5A සහ SI උපග්රන්ථය, වගුව S1) මගින් ඉවත් කරන ලදී.වැදගත් කරුණක් නම්, නොකැපූ nsp9 අඩංගු පූර්වගාමියා nsp7-11-His6 nsp12 හි NMPylation වලට ප්‍රතිරෝධය පෙන්වූ අතර එය අපගේ දත්ත වලට අනුකූල වේ, nsp9-NMP එකතු කිරීම N-පර්යන්ත ප්‍රාථමික amine හරහා සෑදී ඇති බව පෙන්නුම් කරයි (SI උපග්රන්ථය, Figure S5) .NiRAN උපස්ථර නිශ්චිතභාවය පිළිබඳ ගැඹුරු අවබෝධයක් ලබා ගැනීම සඳහා, අපි පසුව nsp9 හි යාබද N-පර්යන්ත අපද්‍රව්‍ය කෙරෙහි අවධානය යොමු කළෙමු.අනෙකුත් ප්රෝටීන නොමැති විට, ඒවා ව්‍යුහාත්මකව නම්‍යශීලී වන අතර, ඒවා nsp9 (26 28, 38) හි ලේබල් නොකළ ආකාරයෙන් අනාවරණය වීම වළක්වයි, ඒවායේ සීමිත ස්වාභාවික විචලනය පෙන්නුම් කරයි මෙය වැදගත් අනුපිළිවෙලට විශේෂිත (ද්විතියික ව්‍යුහයට සම්බන්ධ නොවේ) nsp9 N-පර්යන්ත කොටසෙහි කාර්යය.මෙම කලාපයේ සංරක්ෂිත අපද්‍රව්‍යවල Ala ආදේශන (රූප සටහන 5C සහ D සහ SI උපග්රන්ථය, Figure S8) හෙළිදරව් කරන්නේ nsp9 NMPylation in vitro සඳහා N3826 අත්‍යවශ්‍ය වන අතර N3825A සහ E3827A ආදේශන NMPylation හි අඩුවීමට හේතු වන අතර M3820A සහ P3820A ආදේශක නොවේ. .පැහැදිලිවම nsp9 NMPylation වලට බලපායි.N-terminal Asn (N3825A, N3825S) ආදේශ කිරීම nsp9 NMPylation සහ සෛල සංස්කෘතියේ වෛරස් ප්‍රතිනිර්මාණයට පමණක් මධ්‍යස්ථ බලපෑමක් ඇති කරයි (රූපය 5C සහ D), N-terminal 3825-NN dipeptide වෙතින් Asn අවශේෂ අනුපිළිවෙලක් මකා දැමීම එය වෛරස් වලට මාරාන්තික බව ඔප්පු විය, N-terminus හි තවත් අවශේෂයකට පෙර එක් Asn අවශේෂයක් අවශ්ය බව පෙන්නුම් කරයි, වඩාත් සුදුසු Asn, නමුත් සමාන අපද්‍රව්‍ය ආදේශ කිරීම අර්ධ වශයෙන් ඉවසාගත හැකි බව පෙනේ (රූපය 5B, C, සහ D).අපි නිගමනය කරන්නේ 3825-NN dipeptide, විශේෂයෙන්ම කොරෝනා වයිරස් පරාසය තුළ සංරක්ෂණය කරන ලද සහ අත්‍යවශ්‍ය N3826 අපද්‍රව්‍ය (SI උපග්රන්ථය, රූපය S6), NiRAN හි ක්රියාකාරී අඩවියේ nsp9 N-terminus හි නිවැරදි බන්ධනය සහ දිශානතිය සහතික කරන බවයි.
සියලුම උප පවුල්වල සංරක්ෂිත Glu සඳහා Ala (E3827A) ආදේශ කිරීම vitro තුළ nsp9 NMPylation රඳවා තබා ගන්නා නමුත් සෛල සංස්කෘතියේ වෛරස් වලට මාරාන්තික වේ (රූපය 5C සහ D), මෙම අවශේෂයේ අතිරේක ක්රියාකාරිත්වය පෙන්නුම් කරයි, උදාහරණයක් ලෙස, ප්‍රධාන අන්තර්ක්‍රියා වලදී (NMPylated හෝ unmodified) ) nsp9 N-terminus සහ වෛරස් අනුවර්තනයට සම්බන්ධ අනෙකුත් සාධක.Nsp9 විකෘති nsp9 හෝ යාබද nsps (39) හි ප්‍රෝටෝලිටික් ක්‍රියාවලියට බල නොපායි (SI උපග්රන්ථය, Figure S9), නිරීක්ෂණය කරන ලද nsp9 විකෘති කිහිපයක මාරාන්තික සංසිද්ධි C ප්‍රෝටියෝලයිටික් ක්‍රියාවලි-පර්යන්ත pp1a ප්රදේශයේ අක්‍රිය වීම නිසා සිදු නොවූ බව පෙන්නුම් කරයි. .
pp1a/pp1ab හි nsp8|9 cleavage site හි Mpro-මැදිහත්කාර ප්‍රතිකාරයෙන් පසුව, nsp9 හි N-terminus UMPylated (හෝ වෙනත් NMP සමඟ අර්ධ වශයෙන් වෙනස් කළ හැක) බවට ඉහත දත්ත සාක්ෂි සපයයි.මීට අමතරව, nsp9 හි N-පර්යන්තයේ විශිෂ්ට සංරක්ෂණය (කොරොන වයිරස් පවුලේ ඒකීය සහ වෙනස් නොවන Asn අවශේෂ ඇතුළුව) සහ මෙම අධ්‍යයනයෙන් ලබාගත් ප්‍රතිලෝම ජාන දත්ත (රූපය 3E සහ 5D) විස්තර කර ඇති nsp9 NMPylation බව නිගමනය කිරීමට අපට හේතු විය. ජීව විද්‍යාත්මකව සම්බන්ධ වන අතර කොරෝනා වයිරස් අනුකරණය සඳහා අත්‍යවශ්‍ය වේ.මෙම වෙනස් කිරීමේ ක්රියාකාරී ප්‍රතිවිපාක අධ්‍යයනය කිරීමට ඉතිරිව ඇත, උදාහරණයක් ලෙස, කලින් විස්තර කරන ලද (විශේෂිත නොවන) nsp9 (වෙනස් නොකළ ආකාරය) RNA බන්ධන ක්‍රියාකාරකම් (2628).N-terminal NMPylation ප්රෝටීන් හෝ RNA උපස්ථර සමඟ nsp9 අන්තර්ක්‍රියා කිරීමට හෝ විවිධ මට්ටම් හතරක එකලස් කිරීම් සෑදීමට ද බලපෑ හැකිය.මේවා ව්යුහාත්මක අධ්‍යයනයන්හිදී නිරීක්ෂණය කර ඇති අතර, විශේෂයෙන්ම මෙම වෙනස් කිරීම (26- ââ29, 40) නොමැති වුවද, කිරීටක වෛරස් අනුකරණයට ක්‍රියාකාරීව සම්බන්ධ බව තහවුරු කර ඇත.
කොරෝනා වයිරස් NiRAN වසමේ ඉලක්ක නිශ්චිතභාවය තවමත් වඩාත් විස්තරාත්මකව සංලක්ෂිත කළ යුතු වුවද, අපගේ දත්ත පෙන්නුම් කරන්නේ කොරෝනා වයිරස් NiRAN වසමේ ප්රෝටීන් ඉලක්ක විශේෂත්වය ඉතා පටු බවයි.සියලුම nidovirus පවුල්වල NiRAN වසමෙහි ඇති ප්‍රධාන සක්‍රීය අඩවි අපද්‍රව්‍ය (8, 16) සංරක්ෂණය කිරීම මෙම ප්රෝටීන සංරක්ෂිත NMPylator වල ක්‍රියාකාරිත්වයට දැඩි ලෙස සහාය වුවද, මෙම වසමේ උපස්ථර බන්ධන සාක්කුවේ අපද්‍රව්‍යවල අනන්‍යතාවය සංරක්ෂණය සහ සංරක්ෂණය සංලක්ෂිතව පවතී. , සහ Nidovirales අරමුණු විවිධ පවුල් අතර වෙනස් විය හැක.ඒ හා සමානව, අනෙකුත් කැදලි වෛරස් වල අදාළ ඉලක්ක තවමත් තීරණය කර නොමැත.ඒවා nsp9 හෝ වෙනත් ප්රෝටීන වල දුරස්ථ විකලාංග විය හැකිය, මන්ද සාමාන්‍යයෙන් කැදලි වෛරස් වල සංරක්ෂණය කර ඇති අනුපිටපත් වසම් පහෙන් පිටත අනුපිළිවෙල අඩු සංරක්ෂණය (8), Mpro සහ NiRAN අතර ඇති ජෙනෝම අරාව ද ඇතුළුව, ඒවා අතර, nsp9 පිහිටා ඇත්තේ කොරෝනා වයිරසය.
මීට අමතරව, අපට දැනට NiRAN වසමට අමතර (සෙලියුලර් ඇතුළුව) ඉලක්ක තිබීමේ හැකියාව බැහැර කළ නොහැක.මෙම අවස්ථාවේ දී, මෙම නැගී එන ප්රෝටීන් NMPylators (NMPylators) (30, 31) හි ඇති බැක්ටීරියා සමලිංගිකයන් “ප්‍රධාන නියාමකයින්” ඇති බව සඳහන් කිරීම වටී?NMP විවිධ සෛලීය ප්රෝටීන ඒවායේ පහළ ක්‍රියාකාරකම් නියාමනය කිරීමට හෝ ඉවත් කිරීමට මොඩියුලේට් කරයි, එමඟින් සෛලීය ආතති ප්‍රතිචාරය සහ රෙඩොක්ස් හෝමියස්ටැසිස් (22, 33) වැනි විවිධ ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාවලීන්හි කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි.
මෙම අධ්‍යයනයේදී (රූප සටහන 2 සහ 4 සහ SI උපග්රන්ථය, රූප S3 සහ S5), nsp12 විසින් UMP (NMP) කොටස nsp9 හි තනි (සංරක්ෂිත) ස්ථානයකට මාරු කළ බව ඔප්පු කිරීමට අපට හැකි විය, නමුත් අනෙකුත් ප්රෝටීන වල වෙනස් කර නොතිබුණි. කොන්දේසි යටතේ, හොඳින් නිර්වචනය කරන ලද (ලිහිල් වෙනුවට) උපස්ථර විශේෂත්වය සඳහා සහය දක්වයි.මෙයට අනුකූලව, N-terminal nsp9 NMPylation හා සසඳන විට, nsp12′ගේම NMPylation ක්‍රියාකාරකම් ඉතා අඩුය, එය හඳුනාගැනීම සඳහා දිගු ස්වයංක්‍රීය විකිරණ නිරාවරණ කාලය අවශ්ය වන අතර nsp12 සාන්ද්‍රණයේ 10 ගුණයක වැඩි වීමක් භාවිතා වේ.මීට අමතරව, අපගේ MS විශ්ලේෂණය nsp12 හි NMPylation සඳහා සාක්ෂි සැපයීමට අපොහොසත් විය, එයින් ඇඟවෙන්නේ NiRAN වසම ස්වයං-NMPylation (හොඳම) ද්විතියික ක්‍රියාකාරකමක් බවයි.කෙසේ වෙතත්, වෙනත් අධ්‍යයනයන් මගින් බැක්ටීරියා NMPylator හි ස්වයං-AMPylation තත්ත්වය අනෙකුත් ප්රෝටීන් උපස්ථර (22, 33) මත ඔවුන්ගේ NMPylation ක්‍රියාකාරකම් පාලනය කළ හැකි බවට මූලික සාක්ෂි සපයා ඇති බව සැලකිල්ලට ගත යුතුය.එබැවින්, EAV nsp9 (16) සහ කොරෝනා වයිරස් nsp12 (මෙම අධ්‍යයනය) සඳහා වාර්තා කරන ලද ස්වයං-NMPylation ක්‍රියාකාරකම්වල ඇති විය හැකි ක්රියාකාරී බලපෑම් විමර්ශනය කිරීමට වැඩි පර්යේෂණ අවශ්ය වේ, C-terminal RdRp වසම (C-terminal RdRp වසම නැමීමට යෝජිත chaperone වැනි බලපෑම ඇතුළුව. 16)).
මින් පෙර, RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase සහ protein priming activity (16) ඇතුළුව nidoviral NiRAN වසමෙහි ඇති විය හැකි පහළ ශ්‍රිත පිළිබඳ උපකල්පන කිහිපයක් සලකා බලා ඇත, නමුත් ඒවා කිසිවක් පවතින පහළ ශ්‍රිත සමඟ නොගැළපේ.පහත දැක්වෙන තනතුරු වලින් ලබාගත් තොරතුරු අතිරේක උපකල්පන සිදු නොකර හරියටම එකම වේලාවකි.මෙම අධ්‍යයනයෙන් ලබාගත් දත්ත NiRAN වසම ප්රෝටීන්-ප්රේරිත RNA සංස්ලේෂණය ආරම්භ කිරීමට සම්බන්ධ බව (නමුත් ඔප්පු කළ නොහැක) සමග වඩාත් අනුකූල වේ.5 හි NiRAN වසමේ ක්රියාකාරිත්වය බව කලින් විශ්වාස කරන ලදී ??²-RNA ආවරණ හෝ RNA බන්ධන ප්රතික්රියා මේවායින් සහ වෙනත් දත්තවල සහාය බලපාන්නේ නැත.එබැවින්, උදාහරණයක් ලෙස, NiRAN හි සක්‍රීය අඩවිය සාමාන්‍ය පදනමක් ලෙස සංරක්ෂණය කරන ලද Asp සම්බන්ධ වන බව සැලකේ (Pseudomonas syringae SelO හි D252; HCoV-229E pp1ab හි D4271; SARS-CoV-2 nsp12 හි D208) (SI උපග්රන්ථය 2 රූපය 2 )S2) (17, 22, 33), ATP මත යැපෙන RNA ligase සහ RNA ආවරණ එන්සයිමයේ උත්ප්‍රේරණය සිදු කරනු ලබන්නේ සහසංයුජ එන්සයිමය-(lysyl-N)-NMP අතරමැදි, එයට වෙනස් නොවන Lys අවශේෂයක් ( 41)ඊට අමතරව, සංරක්ෂිත ප්රෝටීන් ඉලක්ක සඳහා කොරෝනා වයිරස් NiRAN හි කැපී පෙනෙන අනුක්‍රමය පදනම් වූ විශේෂත්වය සහ NTP සම-උපස්ථර සඳහා ලිහිල් විශේෂත්වය (UTP කැමති) NiRAN-මැදිහත් වූ ආවරණ එන්සයිම හෝ RNA ligase වැනි ක්‍රියාකාරකම් වලට විරුද්ධ වේ.
පැහැදිලිවම, ප්රෝටීන් ප්රේරිත RNA සංස්ලේෂණයේදී nsp9-UMP (nsp9-NMP) හි ඇති විය හැකි කාර්යභාරය සත්‍යාපනය කිරීමට සහ, ඔප්පු කළහොත්, විස්තාරනය කිරීමට අමතර වැඩ ගොඩක් අවශ්ය වේ, එය කලින් වාර්තා කළ රසවත් නමුත් (මෙතෙක්) වාර්තා කිහිපයක් සම්බන්ධ කරයි. .හුදකලා නිරීක්ෂණ.උදාහරණයක් ලෙස, කොරෝනා වයිරසයේ සෘණ-තන්තු RNA හි අවසානය ඔලිගෝ (U) නූල් (42, 43) සමඟ ආරම්භ වන බව තීරණය කර ඇත.මෙම නිරීක්ෂණය සෘණ-තන්තු RNA හි සංශ්ලේෂණය ආරම්භ වන්නේ nsp9 හි UMPylated ආකාරය පොලි(A) වලිගය (ප්‍රේරක) වෙත බන්ධනය කිරීමෙනි යන අදහසට අනුකූල වේ, එය එහි RNA බන්ධනය මගින් ප්‍රවර්ධනය කළ හැකිය තවත් RTC ප්‍රෝටීනයක්.nsp9 විසින් සපයන ලද UMP කොටස පසුව nsp7/8/nsp12-මැදිහත් ඔලිගොරිඩිලේෂන් සඳහා “ප්‍රාථමිකයක්” ලෙස භාවිතා කළ හැක, ප්‍රවේණික RNA හි 3??²-poly(A) වලිගය හෝ වෙනත් ඔලිගෝ (A) අඩංගු අනුපිළිවෙලක් භාවිතා කරයි. picornavirus VPg ප්රෝටීන් (44) සඳහා ස්ථාපිත යාන්ත්‍රණයට සමාන අච්චුවක් ලෙස ක්‍රියා කරයි.යෝජනාව "සම්මත නොවන" නම් කුමක් කළ යුතුද????(ප්රෝටීන්-ප්රේරිත) සෘණ-තන්තු RNA සංස්ලේෂණයේ ආරම්භය නිරීක්ෂණවලට සබැඳියක් සපයයි, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ කොරෝනා වයිරස් සෘණ-තන්තු RNA අවසානයේ UMP (UTP වෙනුවට) ඇති බවයි (42), එය ඇඟවුම් කිරීමට සැලකේ. නියුක්ලෙයික් අම්ලය ඩයිසර්, නොදන්නා යූරිඩින්-විශේෂිත එන්ඩොනියුක්ලීස් මගින් පොස්පරීකරණය කරන ලද අවසානය කැඩී යයි.තහවුරු වුවහොත්, මෙම න්‍යෂ්ටික අම්ල හයිඩ්‍රොලිටික් ක්‍රියාකාරකම මගින් nsp9 හි oligomeric UMPylated ආකාරය නව සෘණ නූල්වල 5² අන්තයෙන් මුදා හැරීමට උපකාරී වේ.ප්රෝටීන් ප්‍රාථමිකකරණයේදී nsp9 හි විය හැකි කාර්යභාරය පෙර ප්‍රතිලෝම ප්‍රවේණි අධ්‍යයනයන් සමඟ ද අනුකූල වේ, nsp9 (සහ nsp8) කොරෝනා වයිරස් ජෙනෝමයේ 3 අන්තය අසල සංරක්ෂිත සිස්-ක්රියාකාරී RNA මූලද්‍රව්‍ය සමඟ විවේචනාත්මකව සහ විශේෂයෙන් අන්තර්ක්‍රියා කරන බව පෙන්වා දී ඇත.45)මෙම වාර්තාවට අනුව, මෙම පෙර නිරීක්ෂණ දැන් නැවත පරීක්ෂා කර වැඩිදුර පර්යේෂණ හරහා පුළුල් කළ හැකිය.
සාරාංශයක් ලෙස, අපගේ දත්ත මගින් N-terminus හි RdRp වෙත සම්බන්ධ කර ඇති හිමිකාර කැදලි වෛරස් එන්සයිම ටැගයක නිශ්චිත ක්‍රියාකාරකම් තීරණය කරන ලදී.කිරීටක වයිරසයේදී, මෙම අලුතින් සොයාගත් NiRAN-මැදිහත් වූ UMPylator/NMPylator ක්‍රියාකාරකම් Mn2+ සහ යාබද Asn අපද්‍රව්‍ය මත විශ්වාසය තැබීමට භාවිතා කරන අතර N-පර්යන්ත ප්‍රාථමික ඇමයින් සමඟ (අඩු ශක්ති) ෆොස්ෆොරමයිඩ් බන්ධන සෑදීමට හේතු වේ.nsp8|9 cleavage site හි Mpro-මැදිහත් වූ cleavage හරහා, nsp9 ඉලක්කය NMPylation සඳහා භාවිතා කළ හැක, RdRp දක්වා විහිදෙන protease සහ NiRAN වසම අතර ක්රියාකාරී සම්බන්ධ කිරීම පෙන්නුම් කරයි.nsp12 NiRAN සක්‍රීය අඩවියේ ඇති ප්‍රධාන අපද්‍රව්‍ය සංරක්ෂණය කිරීම සහ nsp9 ඉලක්කය, SARS-CoV-2 ඇතුළු කොරොන වයිරස් දෙකකින් ලබාගත් දත්ත සමඟ ඒකාබද්ධව, nsp9 NMPylation කොරොන වයිරස් කොන්සර්වේටිව් විශේෂාංග ද වෛරස් අනුකරණයේ ප්‍රධාන පියවරක් බවට ප්‍රබල සාක්ෂි සපයයි.ප්රෝටීන්-ප්රේරිත RNA සංශ්ලේෂණයේදී NMP9 හි NMPylated ආකාරයේ නිශ්චිත කාර්යභාරය කොරෝනා වයිරස් සහ අනෙකුත් කැදලි වෛරස් සඳහා සාධාරණ අවස්ථාවක් වන අතර NiRAN වෙනත් හඳුනා නොගත් ප්රෝටීන් ඉලක්ක කළ හැකි බව පවතින දත්ත අපට නිගමනය කරයි.වෛරසය නියාමනය කරන්න.සත්කාරක අන්තර්ක්‍රියා.තහවුරු වුවහොත්, වෛරස් RNA සංස්ලේෂණයට ප්රෝටීන් ප්‍රයිමර් සම්බන්ධ වීම, කලින් හඳුනාගත් කොරොන වයිරස් සහ පිකෝනා වයිරස් වැනි සුපිරි සමූහය (9) අතර Mpro/3CLpro සහ RdRp වසම්වල අනුක්‍රමික සම්බන්ධතාවය වැඩි කරනු ඇත, ඒවා දැන් මෑතකදී පිහිටුවන ලද Pisonivirites (9) තුළ ඒකාබද්ධ කර ඇත. 46) කාණ්ඩයේ.
මෙම අධ්‍යයනයේ දී හඳුනාගත් මූලික, තෝරාගත් සහ ගතානුගතික එන්සයිම ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රතිවෛරස් ඖෂධ සඳහා ඉලක්ක ලෙස භාවිත කළ හැකි බව ද අපගේ දත්ත පෙන්වා දෙයි.NiRAN හි සක්‍රීය අඩවියේ සංරක්ෂණය කරන ලද nsp9 N-terminus හි බන්ධනයට බාධා කරන (සහ පසුව වෙනස් කිරීම්) විවිධ (උප) ගණ ආසාදනවලින් සත්ව හා මානව කිරීටක වෛරස් වලට ප්‍රතිකාර කිරීම සඳහා සුදුසු ඵලදායී සහ බහුකාර්ය ප්‍රතිවෛරස් ඖෂධ බවට වර්ධනය කළ හැක. SARS-CoV-2 සහ මැදපෙරදිග ශ්වසන සින්ඩ්‍රෝමය කොරෝනා වයිරස් ඇතුළුව.
මෙම අධ්‍යයනයේදී නිපදවන ලද කොරෝනා වයිරස් ප්‍රෝටීනයේ කේතීකරණ අනුක්‍රමය RT-PCR මගින් HCoV-229E ආසාදිත Huh-7 වෙතින් හුදකලා වූ RNA භාවිතයෙන් හෝ SARS-CoV-2 ආසාදිත Vero E6 මගින් විස්තාරණය කර සම්මත ක්ලෝනකරණ ක්‍රියා පටිපාටි භාවිතයෙන් ඇතුළත් කරන ලදී.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) හෝ pASK3-Ub-CHis6 (47) ප්‍රකාශන දෛශිකය (SI උපග්රන්ථය, වගු S1 සහ S2).තනි කෝඩෝන ආදේශන PCR-පාදක අඩවි-මෙහෙයවන විකෘති (48) මගින් හඳුන්වා දෙන ලදී.MBP විලයන ප්‍රෝටීනය නිපදවීම සඳහා, E. coli TB1 සෛල සුදුසු pMAL-c2 ප්ලාස්මිඩ් ගොඩනැගීම (SI උපග්රන්ථය, වගුව S1) සමඟ පරිවර්තනය කරන ලදී.විලයන ප්‍රෝටීනය ඇමයිලෝස් ඇෆිනිටි ක්‍රොමැටෝග්‍රැෆි මගින් පවිත්‍ර කර Xa සාධකයෙන් වෙන් කරන ලදී.පසුව, C-terminal His6-ටැග් කරන ලද ප්‍රෝටීනය කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) මගින් පිරිසිදු කරන ලදී (49).ubiquitin විලයන ප්‍රෝටීනය නිපදවීම සඳහා E. coli TB1 සෛල සුදුසු pASK3-Ub-CHis6 ප්ලාස්මිඩ් නිර්මිතය (SI උපග්රන්ථය, වගු S1 සහ S2) සහ pCGI ප්ලාස්මිඩ් DNA කේතනය ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1) භාවිතා කරන ලදී.පරිවර්තනය (47).C-terminal His6-ටැග් කර ඇති කොරෝනා වයිරස් ප්‍රෝටීනය කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි පිරිසිදු කරන ලදී (50).
HCoV-229E nsp12-His6 හි ස්වයං-NMPylation පරීක්ෂණය EAV nsp9 (16) හි විස්තර කර ඇති පරිදි සිදු කරන ලදී.කෙටියෙන් කිවහොත්, nsp12-His6 (0.5 µM) හි 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic අම්ලය (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, buffer 25 mM අඩංගු වේ. නිශ්චිත NTP සහ 0.17 µM ගැලපෙන [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) 30 °C දී විනාඩි 30 ක් සඳහා.nsp12-මැදිහත් වූ nsp9 NMPylation හි අනෙකුත් සියලුම (සම්මත) NMPylation විශ්ලේෂණයන්හිදී, ප්රතික්රියා තත්ත්වයන් පහත පරිදි සකස් කර ඇත: nsp12-His6 (0.05 µM) සහ nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (HEPES-KOH) හමුවේ. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM දක්වා ඇති NTP, සහ 0.17 µM ගැලපෙන [α32-P]NTP.30°C දී මිනිත්තු 10ක් පුර්ව ඝෝෂා කිරීමෙන් පසුව, ප්රතික්රියා නියැදිය SDS-PAGE නියැදි බෆරය සමඟ මිශ්‍ර කර ඇත: 62.5 mM ට්‍රයිස් (හයිඩ්‍රොක්සිමීතයිල්) ඇමයිනොමෙතේන් HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glycerol සහ 0.0005% නිල්.ප්‍රෝටීනය විනාඩි 5ක් 90 °C රත් කිරීමෙන් සහ 12% SDS-PAGE මගින් වෙන් කරන ලදී.මෙම ජෙල් Coomassie Brilliant Blue ද්‍රාවණයෙන් (40% මෙතනෝල්, 10% ඇසිටික් අම්ලය, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250) සවි කර පැල්ලම් කර ඇත, අවර්ණ කර පැය 20ක් (NMPylation වෙතින් nsp12 හඳුනා ගැනීමට) පොස්පරස් රූප තිරයකට නිරාවරණය කර ඇත. හෝ (උපරිම) 2 පැය (nsp9 NMPylation තක්සේරු කිරීමට).තිරය පරිලෝකනය කිරීමට Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) භාවිතා කරන ලද අතර සංඥා තීව්‍රතාවය විශ්ලේෂණය කිරීමට ImageJ භාවිතා කරන ලදී.
MS විශ්ලේෂණය සඳහා, NMPylation විශ්ලේෂණයේදී (SI උපග්රන්ථය, වගුව S1) 1 µM nsp12-His6 සහ 10 µM nsp9 (හෙක්සාහිස්ටිඩින් ටැග් නොමැතිව) භාවිතා කරන ලද අතර 500 µM UTP සහ GTP සාන්ද්‍රණය වැඩි කරන ලදී.ඒවායේ සාන්ද්‍රණය සහ අපේක්ෂිත ප්රෝටීන් ගුණාත්මක භාවය මත පදනම්ව, අන්තර්ජාලය හරහා බෆර කරන ලද ප්රෝටීන් ද්‍රාවණ 1 සිට 10 µL දක්වා ලුණු ඉවත් කිරීම සඳහා MassPrep තීරුවකින් (Waters) සමන්විත Waters ACQUITY H-Class HPLC පද්ධතියක් භාවිතා කරන ලදී.පහත සඳහන් බෆර A (ජලය/0.05% ෆෝමික් අම්ලය) සහ බෆර B (ඇසිටොනිට්‍රයිල්/0.045% ෆෝමික් අම්ලය) අනුක්‍රමය හරහා ඩීසල් කළ ප්‍රෝටීනය Synapt G2Si ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයේ (Waters) විද්‍යුත් ඉසින අයන ප්‍රභවයට මුදා හරිනු ලැබේ. 60 ° C සහ 0.1 mL/min ප්‍රවාහ අනුපාතය: මිනිත්තු 2ක් සඳහා 5% A සමඟ සමස්ථානිකව ඉවත් කිරීම, පසුව මිනිත්තු 8ක් ඇතුළත 95% B දක්වා රේඛීය අනුක්‍රමණය සහ තවත් විනාඩි 4ක් සඳහා 95% B පවත්වා ගැනීම.
500 සිට 5000 m/z ස්කන්ධ පරාසයක් සහිත ධනාත්මක අයන අනාවරණය වේ.ස්වයංක්‍රීය ස්කන්ධ ප්ලාවිතය නිවැරදි කිරීම සඳහා Glu-fibrinopeptide B සෑම තත්පර 45 කට වරක් මනිනු ලැබේ.MaxEnt1 දිගුව සමඟ MassLynx උපකරණ මෘදුකාංගය භාවිතා කර මූලික වර්ණාවලිය අඩු කර සුමටනය කිරීමෙන් පසු සාමාන්‍ය වර්ණාවලිය විසංයෝජනය කරන්න.
UMPylated HCoV-229E nsp9 අනුක්‍රමික-ශ්‍රේණියේ නවීකරණය කරන ලද ට්‍රයිප්සින් (සර්වා) එකතු කිරීමෙන් දිරවන ලද අතර එක රැයකින් 37 °C දී පුර්වාංගත කරන ලදී.ක්‍රෝමබොන්ඩ් C18WP භ්‍රමණය තීරුවක් (කොටස් අංක 730522; Macherey-Nagel) පෙප්ටයිඩ ලුණු ඉවත් කිරීමට සහ සාන්ද්‍රණය කිරීමට භාවිතා කරන ලදී.අවසාන වශයෙන්, පෙප්ටයිඩය ජලය 25 µL තුළ දිය කරන ලදී, එහි 5% ඇසිටොනයිට්‍රයිල් සහ 0.1% ෆෝමික් අම්ලය අඩංගු විය.
සාම්පල MS විසින් Orbitrap Velos Pro ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයක් (Thermo Scientific) භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.අවසාන nanoâ HPLC පද්ධතිය (Dionex), අභිරුචි අග සවිකර ඇති සෙන්ටිමීටර 50 කින් සමන්විත වේ??75 μm C18 RP තීරුව 2.4 μm චුම්බක පබළු (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) ඇසුරුම් කර Proxeon නැනෝස්ප්‍රේ මූලාශ්‍රය හරහා ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයට සබැඳිව සම්බන්ධ කරන්න;ට්‍රයිප්සින් දිරවීමේ ද්‍රාවණය 6 µL 300 µm අභ්‍යන්තර විෂ්කම්භයකට එන්නත් කරන්න ×??1 cm C18 PepMap පූර්ව සාන්ද්‍රණ තීරුව (Thermo Scientific).ද්‍රාවකය ලෙස ජලය/0.05% ෆෝමික් අම්ලය භාවිතා කරමින්, නියැදිය ස්වයංක්‍රීයව සිරවී 6 µL/min ප්‍රවාහ අනුපාතයකින් ලවණ ඉවත් කරන ලදී.
ට්‍රයිප්ටික් පෙප්ටයිඩ 300 nL/min ප්‍රවාහ අනුපාතයකින් වෙන් කිරීම සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා ජලය/0.05% ෆෝමික් අම්ලය (ද්‍රාවක A) සහ 80% ඇසිටොනිට්‍රයිල්/0.045% ෆෝමික් අම්ලය (ද්‍රාවක B) පහත දැක්වෙන අනුක්‍රමණයන් භාවිතා කරන ලදී: 4% B සඳහා මිනිත්තු 5 ක්, පසුව 30 A රේඛීය අනුක්‍රමණය මිනිත්තු කිහිපයක් ඇතුළත 45% B දක්වා, සහ රේඛීය වැඩි වීම විනාඩි 5 ක් ඇතුළත 95% ද්‍රාවක B දක්වා.වර්ණලේඛන තීරුව මල නොබැඳෙන වානේ නැනෝ විමෝචකයකට (Proxeon) සම්බන්ධ කර ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයේ රත් වූ කේශනාලිකා වෙත 2,300 V විභවයක් භාවිතා කරමින් ප්‍රත්‍යාවර්තකය සෘජුවම ඉසින්න. Orbitrap ස්කන්ධ විශ්ලේෂකය තුළ 60,000 ක විභේදනයකින් යුත් සමීක්ෂණ ස්කෑන් කිරීම සම්බන්ධ වේ. අවම වශයෙන් දත්ත තුනක් MS/MS ස්කෑන් සමග, ගතිකව තත්පර 30 සඳහා බැහැර, රේඛීය අයන උගුල් ඝට්ටනය ප්රේරිත විඝටනය හෝ orbitrap හඳුනාගැනීම සමඟ ඒකාබද්ධ වූ ඉහළ ශක්ති ඝට්ටන විඝටනය භාවිතා කරමින්, විභේදනය 7,500 වේ.
පසු කාලය: අගෝස්තු-03-2021